فهرست مطالب

عنوان	صفحه
چکیده...........................................................................................................................	1
فصل اول : مقدمه
1-1 مقدمه....................................................................................................................	2
1-2 اهمیت موضوع......................................................................................................	3
1-3 فرضیات................................................................................................................	7
1-4 اهداف پژوهش......................................................................................................	7
فصل دوم : مروری بر منابع
2-1 کلیات....................................................................................................................	8
2-1-1 تاریخچه گیاه آلوئه‌ورا.......................................................................................	8
2-1-گیاهشناسی...........................................................................................................	9
2-1-3 تکثیر.................................................................................................................	10
2-1-4 گونه‌ها...............................................................................................................	11
2-1-5 نیازهای اکولوژیکی...........................................................................................	11
2-1-6 خواستگاه و دامنه انتشار....................................................................................	11
2-1-7 خواص دارویی و موارد استفاده.........................................................................	12
2-1-8 موادموثره و ترکیبات.........................................................................................	12
2-2 کشت بافت گیاهی.................................................................................................	15
2-2-1 تاریخچه کشت بافت گیاهی..............................................................................	15
2-2-2 اهداف کشت بافت گیاهی.................................................................................	16
2-2-3 تعریف کشت بافت گیاهی.................................................................................	16
2-2-4 انواع کشت بافت گیاهی....................................................................................	17
2-2-5 بررسی اثرات فاکتورهای مختلف در محیط کشت.............................................	18
2-2-6 نمک‌های غیرآلی...............................................................................................	19
2-2-7 ویتامین‌ها..........................................................................................................	19
2-2-8 منبع انرژی.........................................................................................................	19
2-2-9 عوامل فیزیکی...................................................................................................	20
2-2-10 ریزنمونه..........................................................................................................	20
2-2-11 pHمحیط.......................................................................................................	20
2-2-12 چگونگی انتخاب محیط کشت.........................................................................	20
2-2-13 ریشه‌زائی........................................................................................................	21
2-3 هورمون‌ها..............................................................................................................	21
2-3-1 اکسین‌ها............................................................................................................	21
2-3-2 سایتوکینین‌ها.....................................................................................................	22
2-4 کالوس‌زایی...........................................................................................................	23
2-4-1 انواع کالوس.....................................................................................................	23
2-4-2 مراحل رشد کالوس...........................................................................................	24
2-4-3 اندازه گیری رشد کالوس..................................................................................	24
2-4-4 آلودگی در کشت کالوس..................................................................................	24
2-4-5 تاثیر هورمون‌ها در القای کالوس.......................................................................	25
2-5 کنترل قهوه‌ای شدن................................................................................................	29
2-6 تولید متابولیت‌های ثانویه.......................................................................................	32
2-7 ریزازدیادی............................................................................................................	34
2-7-1 ریزازدیادی گیاهان از طریق کشت بافت............................................................	34
2-7-2 انتخاب ریزنمونه................................................................................................	35
2-7-3 تاثیر هورمون‌ها در ریزازدیادی..........................................................................	36
2-7-4 تاثیر هورمون‌ها در باززایی................................................................................	40
فصل سوم : مواد و روش‌ها
3-1 مواد گیاهی............................................................................................................	43
3-2 کشت بافت............................................................................................................	43
3-2-1 تهیه محلول ذخیره محیط‌های کشت...................................................................	43
3-2-1-1 تهیه محلول ذخیره عناصر ماکرو....................................................................	44
3-2-1-2 تهیه محلول ذخیره عناصر میکرو...................................................................	44
3-2-1-3 تهیه محلول ذخیره آهن – سدیم....................................................................	44
3-2-1-4 تهیه محلول ذخیره ویتامین ها........................................................................	44
3-2-1-5 هورمون‌ها.....................................................................................................	45
3-3- تهیه محیط کشت.................................................................................................	45
3-4 ضدعفونی نمونه‌های گیاهی...................................................................................	45
3-4-1 ضدعفونی اندام گیاهی .....................................................................................	46
3-5 تهیه ریزنمونه.........................................................................................................	46
3-6 روش انجام پژوهش...............................................................................................	47
3-6-1 تکثیر.................................................................................................................	47
3-6-2 ریزازدیادی........................................................................................................	47
3-6-2-1 اثر هورمون اکسین........................................................................................	48
3-6-2-2 اثر هورمون سیتوکینین...................................................................................	48
3-6-3 تاثیر هورمون‌های اکسین بر روی القای کالوس..................................................	48
3-6-4 تاثیر هورمون‌های اکسین بر میزان ترکیبات پلی فنلی.........................................	49
3-6-4-1 روش اندازه‌گیری ترکیبات پلی‌فنل................................................................	49
3-6-4-2 منحنی استاندارد پلی‌فنل‌ها............................................................................	49
3-7 صفات مورفولوژیکی مورد بررسی و روش اندازه‌گیری آن‌ها.................................	50
3-7-1 تعداد برگ.........................................................................................................	50
3-7-2 تعداد ریشه........................................................................................................	50
3-7-3 طول برگ..........................................................................................................	50
3-7-4 طول ریشه.........................................................................................................	50
3-7-5 تعداد روز تا القای کالوس.................................................................................	50
3-7-6 درصد کالوس‌زایی............................................................................................	50
3-7-7 مورفولوژی کالوس...........................................................................................	51
3-7-8 وزن خشک کالوس...........................................................................................	51
3-8 آنالیز آماری و تجزیه و تحلیل داده‌ها.....................................................................	51
فصل چهارم : نتایج
4-1 تاثیر هورمون سیتوکینین بر صفات رویشی.............................................................	52
4-1-1 هورمون BAP..................................................................................................	52
4-1-1-1 تعداد برگ....................................................................................................	52
4-1-1-2 طول برگ.....................................................................................................	54
4-1-1-3 تعداد ریشه...................................................................................................	56
4-1-1-4 طول ریشه.....................................................................................................	58
4-1-2 هورمون Kin....................................................................................................	60
4-1-2-1 تعداد برگ....................................................................................................	60
4-1-2-2 طول برگ.....................................................................................................	62
4-1-2-3 تعداد ریشه...................................................................................................	64
4-1-2-4 طول ریشه.....................................................................................................	66
4-2 تاثیر هورمون اکسین بر صفات رویشی..................................................................	68
4-2-1 هورمون NAA.................................................................................................	68
4-2-1-1 تعداد برگ....................................................................................................	68
4-2-1-2 طول برگ.....................................................................................................	71
4-2-1-3 تعداد ریشه...................................................................................................	73
4-2-1-4 طول ریشه.....................................................................................................	75
4-2-2 هورمون IBA...................................................................................................	77
4-2-2-1 تعداد برگ....................................................................................................	77
4-2-2-2 طول برگ.....................................................................................................	79
4-2-2-3 تعداد ریشه...................................................................................................	81
4-2-2-4 طول ریشه.....................................................................................................	83
4-3 بررسی اثرمتقابل هورمون‌ها بر صفات رویشی........................................................	85
4-3-1 تعداد برگ.........................................................................................................	85
4-3-2 طول برگ..........................................................................................................	88
4-3-3 تعداد ریشه........................................................................................................	91
4-3-4 طول ریشه.........................................................................................................	94
4-4 بررسی تاثیر هورمون‌های اکسین بر روی القای کالوس..........................................	96
4-5 بررسی تاثیر هورمون‌های اکسین بر روی میزان فنل................................................	99
فصل پنجم : بحث
5-1 بحث......................................................................................................................	102
5-1-1 ریزازدیادی........................................................................................................	102
5-1-2 تعداد برگ.........................................................................................................	102
5-1-3 طول برگ..........................................................................................................	106
5-1-4 تعداد ریشه........................................................................................................	108
5-1-5 طول ریشه.........................................................................................................	110
5-1-6 تاثیر اکسین‌ها برالقای کالوس............................................................................	111
5-2 پیشنهادات.............................................................................................................	114
فهرست منابع.................................................................................................................	115
پیوست..........................................................................................................................	123
چکیده انگلیسی.............................................................................................................	126

 

فهرست جدول‌ها

عنوان	صفحه
4-1 تجزیه واریانس اثر هورمون BAP بر تعداد برگ............................................................................	53
4-2 تجزیه واریانس اثر هورمون BAP بر طول برگ.............................................................................	55
4-3 تجزیه واریانس اثر هورمون BAP بر تعداد ریشه...........................................................................	57
4-4 تجزیه واریانس اثر هورمون BAP بر طول ریشه............................................................................	59
4-5 تجزیه واریانس اثر هورمون Kin بر تعداد برگ..............................................................................	61
4-6 تجزیه واریانس اثر هورمون Kin بر طول برگ...............................................................................	63
4-7 تجزیه واریانس اثر هورمون Kin بر تعداد ریشه.............................................................................	65
4-8 تجزیه واریانس اثر هورمون Kin بر طول ریشه..............................................................................	67
4-9 تجزیه واریانس اثر هورمون NAA بر تعداد برگ..........................................................................	69
4-10 تجزیه واریانس اثر هورمون NAA بر طول برگ..........................................................................	72
4-11 تجزیه واریانس اثر هورمون NAA بر تعداد ریشه........................................................................	73
4-12 تجزیه واریانس اثر هورمونNAA بر طول ریشه.........................................................................	76
4-13 تجزیه واریاتس اثر هورمون IBA بر تعداد برگ...........................................................................	78
4-14 تجزیه واریانس اثر هورمون IBA بر طول برگ...........................................................................	80
4-15 تجزیه واریانس اثر هورمون IBA برتعداد ریشه...........................................................................	82
4-16 تجزیه واریانس اثر هورمون IBA برطول ریشه...........................................................................	84
4-17 تجزیه واریانس اثرمتقابل هورمون BAP و IBA بر تعداد برگ...................................................	87
4-18 تجزیه واریانس اثرمتقابل هورمون Kin و IBA بر طول برگ......................................................	90
4-19 تجزیه واریانس اثرمتقابل هورمون Kin و NAA بر تعداد برگ...................................................	93
4-20 تجزیه واریانس اثرمتقابل هورمون Kin و NAA بر طول ریشه....................................................	95
4-21 تاثیر هورمون های اکسین بر روی القای کالوس............................................................................	97
4-22 تجزیه واریانس تاثیر هورمون‌های اکسین بر میزان فنل...................................................................	100

 

 

 

فهرست شکل‌ها

عنوان	صفحه
2-1 گیاه آلوئه‌ورا..................................................................................................................................	6
2-2 گل‌های زردرنگ و گل‌آذین خوشه‌ای گیاه آلوئه‌ورا.........................................................................	10
2-3 ترکیبات آلوئه‌ورا...........................................................................................................................	14
2-4 ساختار شیمیایی ترکیبات گیاه آلوئه‌ورا...........................................................................................	15
3-3 تکثیر گیاه آلوئه‌ورا.........................................................................................................................	47
3-4 کالوس‌های از بین رفته در اثر تولید ترکیبات فنلی..........................................................................	49
4-1 مقایسه تعداد برگ در هورمون BAP.............................................................................................	54
4-2 مقایسه طول برگ در هورمون BAP..............................................................................................	56
4-3 مقایسه تعداد ریشه در هورمون BAP............................................................................................	58
4-4 مقایسه طول ریشه در هورمون BAP.............................................................................................	60
4-5 مقایسه تعداد برگ در هورمون Kin...............................................................................................	62
4-6 مقایسه طول برگ در هورمون Kin.................................................................................................	64
4-7 مقایسه تعداد ریشه در هورمون Kin..............................................................................................	66
4-8 مقایسه طول ریشه در هورمون Kin...............................................................................................	68
4-9 مقایسه تعداد برگ در هورمون NAA.............................................................................................	70
4-10 مقایسه طول برگ در هورمون NAA...........................................................................................	72
4-11 مقایسه تعداد ریشه در هورمون NAA.........................................................................................	75
4-12 مقایسه طول ریشه در هورمون NAA...........................................................................................	77
4-13 مقایسه تعداد برگ در هورمون IBA............................................................................................	79
4-14 مقایسه طول برگ در هورمون IBA..............................................................................................	81
4-15 مقایسه تعداد ریشه در هورمون IBA...........................................................................................	83
4-16 مقایسه طول ریشه در هورمون IBA............................................................................................	85
4-17 اثر متقابل هورمون ها بر تعداد برگ..............................................................................................	88
4-18 اثر متقابل هورمون ها بر طول برگ...............................................................................................	91
4-19 اثر متقابل هورمون ها بر تعداد ریشه.............................................................................................	93
4-20 اثر متقابل هورمون ها بر طول ریشه..............................................................................................	96
4-21 تاثیر هورمون‌های اکسین در القای کالوس....................................................................................	99

فهرست نمودارها

عنوان	صفحه
4-1 مقایسه تعداد برگ در هورمون BAP.............................................................................................	52
4-2 مقایسه طول برگ در هورمون BAP...............................................................................................	55
4-3 مقایسه تعداد ریشه در هورمون BAP............................................................................................	57
4-4 مقایسه طول ریشه در هورمون BAP..............................................................................................	59
4-5 مقایسه تعداد برگ در هورمون Kin...............................................................................................	61
4-6 مقایسه طول برگ در هورمون Kin................................................................................................	63
4-7 مقایسه تعداد ریشه در هورمون Kin..............................................................................................	65
4-8 مقایسه طول ریشه در هورمون Kin................................................................................................	67
4-9 مقایسه تعداد برگ در هورمون NAA.............................................................................................	69
4-10 مقایسه طول برگ در هورمون NAA............................................................................................	71
4-11 مقایسه تعداد ریشه در هورمون NAA.........................................................................................	73
4-12 مقایسه طول ریشه در هورمون NAA...........................................................................................	75
4-13 مقایسه تعداد برگ در هورمون IBA............................................................................................	77
4-14 مقایسه طول برگ در هورمون IBA..............................................................................................	79
4-15 مقایسه تعداد ریشه در هورمون IBA...........................................................................................	81
4-16 مقایسه طول ریشه در هورمون IBA.............................................................................................	83
4-17 مقایسه اثرمتقابل هورمون BAP و IBA بر تعداد برگ................................................................	86
4-18 مقایسه اثرمتقابل هورمون Kin و IBA بر طول برگ ..................................................................	89
4-19 مقایسه اثرمتقابل هورمون Kin و NAA بر تعداد ریشه...............................................................	92
4-20 مقایسه اثرمتقابل هورمون Kin و NAA بر طول ریشه.................................................................	94
4-21 مقایسه تاثیر هورمون‌های اکسین بر القای کالوس..........................................................................	100

 

فهرست علامت‌ها و اختصارها

 

بنزیل آمینو	Benzyl Amino	BA
6- بنزیل آمینو پورین	6-Benzyl Amino Purine	BAP
ایندول-3- اسید استیک	Indol-3- Acetic Acid	IAA
ایندول-3- بوتیریک اسید	Indol-3-Butyric Acid	IBA
1-نفتالین اسید استیک	Naohtalene Acetic Acid	NAA
2و4-دی کلروفنوکسی اسیداستیک	2,4-D-chlorophenoxyacetic Acid	2,4-D
N- ایزو پنتیل امینو پورین	N-isopentenylamino purin	2ip
کینتین	Kinetin	Kin

 

 

فهرست مطالب

عنوان	شماره صفحه
چکیده	1
فصل اول: مقدمه	2
فصل دوم: تاریخچه نیشکر در ایران و جهان	6
2- تاریخچه نیشکر در ایران و جهان	7
1-2 تاریخچه نیشکر در جهان	7
2-2 تاریخچه نیشکر در ایران	7
3-2 اکولوژی نیشکر	9
4-2 مورفولوژی نیشکر	10
1-4-2 ریشه	10
1-1-4-2 ریشه های سطحی	10
2-1-4-2 ریشه های میانی	10
3-1-4-2 ریشه های عمیق	10
2-4-2 ساقه	10
3-4-2 برگ	11
4-4-2 گل	11
5-2 زمان کاشت قلمه های نیشکر	11
6-2 محصولات جانبی نیشکر	12
7-2 ارقام تجاری نیشکر	12
1-7-2 رقم CP48-103	12
2-7-2رقمCp57-614	12
3-7-2 رقم Cp65-315	13
4-7-2 رقم Cp69-1062	13
5-7-2 رقم Cp70-321	13
6-7-2 رقم Sp70-1143	14
7-7-2 رقم Cp73-21	14
8-7-2 رقم IRC99-01	14
8-2 بیماری های نیشکر	15
9-2 بیماریهای نیشکر ایران	15
1-9-2 بیماریهای عفونی	15
2-9-2 بیماریهای غیرعفونی	16
10-2 تنش های گیاهی	16
11-2 فیزیولوژی تنش های گیاهی	17
12-2 تنش های گیاهی از نظر موقعیت جغرافیایی و زیست محیطی در ایران	17
13-2 تنش شوری	18
14-2 علائم خسارت زای شوری	19
15-2 اثرات شوری بر گیاه نیشکر	20
16-2 مبانی سمیت سدیم	22
17-2 مکانیسم های تحمل شوری	23
18-2 سازوکارهای تحمل به شوری	24
19-2 سازگاری کل گیاه به تنش شوری	27
1-19-2 تنظیم انتقال Na به اندام هوایی	27
20-2 مسیرهای اولیه ورود به ریشه	28
1-20-2 مسیر حساس به Ca	28
2-20-2 مسیرهای غیرحساس به Ca	29
3-20-2 مسیر انحرافی	29
21-2 دقع Na به خارج از ریشه	30
1-21-2 کنترل میزان برداشت خالص	30
2-21-2 کنترل بارگیری آوند چوب	31
22-2 عوامل موثر در مقاومت گیاهان به شوری	31
23-2 مطالعات سلول شناختی و ژنتیکی	31
24-2 آنزیم فنیل آلانین آمونیا- لیاز	32
25-2 روش های ارزیابی بیان ژن	34
1-25-2 روش لکه گذاری نورترن	35
2-25-2 ارزیابی حفاظت در برابر R-Nase	35
3-25-2 هیبریدیزاسیون درجا	36
4-25-2 روش RT-PCR	36
5-25-2 روش PCR در زمان حقیقی	36
6-25-2 اصول PCR در زمان حقیقی	37
7-25-2 روش های مختلف آزمون PCR در زمان حقیقی	39
1-7-25-2 روش مبتنی بر کاربرد رنگ های فلئورسنت آزاد	39
2-7-25-2 روش های مبتنی بر پروب	40
3-7-25-2 پروب های هیدرولیز شوند یا TaqMan	40
4-7-25-2 پروب های هیبرید شونده	41
26-2 اصول کاربرد PCR در زمان حقیقی در ارزیابی های کمی	42
27-2 روش عمومی برای محاسبه ی نسبت سنجش نسبی بیان ژن	43
فصل سوم: مواد و روشها	44
1-3 وسایل مورد استفاده	45
2-3 مواد مورد استفاده	45
3-3 روش کار	45
1-3-3 نمونه گیری	45
2-3-3 استخراج RNA	46
1-2-3-3 محلولهای مورد نیاز	46
4-3 واکنش سنتز CDNA (RT)	47
1-4-3 روش ساخت CDNA	47
5-3 واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)	48
1-5-3 روش تهیه محلول (PCR)	48
2-5-3 تهیه ی ژل و ارزیابی محصول PCR	49
3-5-3 روش تهیه ی محلول TAE	49
4-5-3 ساخت رنگ بارگذاری	49
5-5-3 بارگذاری نمونه ها	49
6-3 ارزیابی مقایسه کارایی تکثیرژن کنترل داخلی (GaPDH) و ژنPAL	50
7-3 واکنش PCR در زمان حقیقی	50
1-7-3 روش انجام PCR در زمان حقیقی	50
2-7-3 روش تهیه محلول PCR در زمان حقیقی	50
8-3 بررسی مقایسه ای بیان ژن ها	51
9-3 آنالیز آماری داده ها	51
فصل چهارم: نتایج	52
1-4 تعیین کارایی تکثیر ژن PAL و GAPDH	53
فصل پنجم: بحث	60
پیشنهادات	65
منابع فارسی	66
منابع خارجی	67

 

چکيده:

آنچه که امروزه تحت عنوان نانو تکنولوژي مطرح است آشنا شدن و کنترل کردن بسياري از پديده ها در ابعاد اتمي و آنگسترمي مي باشد. از طرفي استفاده از روش هاي ايمن و دوست دار طبيعت يکي از چالش هاي مهم در عصر کنوني است که بايد به آن توجه ويژه داشت. ميکروب­ها و گياهان به طور ذاتي داراي قابليت کاهش فلزات از طريق مسيرهاي متابوليک ويژه خود هستند. بر اين اساس در مطالعه حاضر گياه يونجه به منظور توليد نانوذرات طلا و نقره مورد استفاده قرار گرفته است. گياهان به مدت 24،48 و72 ساعت در محلول تتراکلرواوريت (1،2 و3 ميلي مولار) و نيترات نقره (5/5، 5/6، 5/7 ميلي مولار) قرار گرفتند تا بتوان از طريق نمونه گيري هر 24 ساعت يک بار زماني که گياه توليد ذرات در مقياس نانو مي کند شناسايي شود اين آزمايش در سه تکرار بر روي سه رقم نيکشهري، همداني و يزدي گياه يونجه انجام شد ،گياهان از طريق طيف سنجي ماوراي بنفش- مرئي (جهت تشخيص وجود نانوذرات طلا و نقره) و ميکروسکوپ الکتروني نگاره همراه با طيف سنج عنصري اشعه ايکس (جهت شناسايي نوع، اندازه و شکل نانوذرات)،دستگاه نانوپارتيکل آنالايزر (جهت تعيين ميانگين قطر ديناميکي کل ذرات) انجام شد با آزمايشات انجام شده وتوليد نانوذرات طلا ونقره در گياه يونجه اثبات شد. اين روش سنتز بيولوژيکي از لحاظ محيط زيست ايمن مي باشند چون فاقد فراورده هاي فرعي سمي مي باشد.

کلمات کليدي: سنتز بيولوژيک، ميکروسکوپ الکتروني روبشي، نانو ذرات طلا.

 

فهرست مطالب

عنوان صفحه

 

فصل اول: مقدمه

1-1- مقدمه..................................... 1

 

فصل دوم: مرور منابع

2-1- فناوري نانو............................... 4

2-2- تعاريف فناوري نانو و گستره آن............. 6

2-3- نانوبيوتکنولوژي........................... 8

2-3-1مزيت­هاي توسعه نانوبيوتکنولوژي............. 9

2-4- ابزار­هاي اندازه­گيري در سطح نانو........... 10

2-4-1- دستگاه اندازه‌گيري جذب نور............... 10

2-4-1-1- کاربردهاي طيف سنجي جذبي .............. 10

2-4-2- دستگاه طيف سنجي عنصري اشعه ايکس......... 11

2-4-3- ميکروسکوپ الکتروني روبشي ............... 11

2-4-3-1- استفاده‌هاي عمومي ..................... 12

2-4-3-2- اندازه نمونه ها....................... 12

2-4-3-3- آماده‌سازي نمونه ها.................... 12

2-4-3-4- محدوديت‌ها............................. 13

2-4-4- دستگاه تفرق ديناميکي نور ليزر........... 13

2-4-5- اسپکترومتري جذب اتمي.................... 16

2-4-6-طيف سنج پراش اشعه ايکس................... 17

2-4-6-1-توليد خطوط طيفي پرتو ايکس ............. 17

2-4-6-2 پراش پرتو ايکس......................... 18

2-4-6-3-روش­هاي پراش پرتو ايکس.................. 18

2-4-6-4-کاربردها............................... 19

2-5- طلا........................................ 19

2-5-1- استخراج طلا.............................. 19

2-5-2- خواص و موارد کاربرد طلا.................. 20

2-5-3- خواص نانوذرات طلا........................ 20

2-5-4- کاربردهاي نانوذرات طلا................... 21

2-5-4-1- کاربردهاي نانوذرات طلا در شيمي به عنوان کاتاليزور 21

2-5-4-2- کاربرد نانوذرات طلا در پزشکي........... 21

2-6- نقره...................................... 22

2-6-1- خصوصيات نقره............................ 22

2-6-2- کاربردها................................ 22

2-6-3- مواجهه با نقره.......................... 23

2-6-4- سازوکار سميت نقره....................... 23

2-7- نيترات نقره............................... 24

2-7-1- خصوصيات................................. 24

2-7-2- مواجهه و سميت........................... 24

2-8- نانوذرات نقره فلزي........................ 24

2-8-1- تعريف................................... 24

2-8-2- کاربردها................................ 24

2-8-3- سازوکار سميت............................ 25

2-8-4- پيشگيري از سميت......................... 25

2-9-روش­هاي توليد نانوذرات...................... 26

2-9-1-سنتز فاز بخار............................ 26

2-9-2-الکتروشيميايي............................ 27

2-9-3-فوتوليز.................................. 27

2-09-4کاهش شيميايي............................. 27

2-9-5-روش آسياب مکانيکي........................ 27

2-9-6-روش تشعشع براي توليد نانو ذرات........... 28

2-9-7 روش قوس الکتريتي براي توليد نانو ذرات ... 29

2-9-8 توليد نانوذرات در محيط پلاسما............. 30

2-10- عصاره گياهان و روش­هاي استخراج عصاره ها... 33

2-10-1- روش­هاي استخراج مواد گياهي.............. 33

2-10-1-1- ماسراسيون(خيس کردن).................. 34

2-10-1-1-1- دستور خيس کردن..................... 35

2-10-1-2- ليکسيوپاسيون( پرکولاسيون)............. 35

2-10-1-3- خيساندن در حرارت..................... 37

2-10-1-4- دم کردن.............................. 37

2-10-1-5- عصاره گيري با حرارت با دستگاه سوکسله. 38

2-11 مروري بر پژوهش­هاي پيشين................... 38

2-11- 1- سنتز نانوذرات طلا در باکتري­ها.......... 39

2-11-2- سنتز نانوذرات طلا دراکتينومايست......... 40

2-11-3- سنتز نانوذرات طلا در مخمر............... 41

2-11-4- سنتز نانوذرات طلا در قارچ­ها............. 41

2-11-5- سنتز نانوذرات طلا در گياهان ............ 42

2-12- نقره..................................... 42

2-12-1- استفاده از باكتري‌ها در سنتز نانوذرات نقره 42

2-12-2- استفاده از مخمر در سنتز نانوذرات نقره.. 43

2-12-3- استفاده از قارچ­ها در سنتز نانوذرات نقره 43

2-12-4- استفاده ازگياهان در سنتز نانوذرات نقره 43

 

فصل سوم: مواد و روش‌ها

3-1-گونه­هاي گياهي مورد استفاده................. 45

3-2- طرز تهيه محلول­هاي ذخيره عناصر غذايي در محيط کشت 45

3-2-1- طرز تهيه محلول­هاي ذخيره عناصر پر مصرف و کم مصرف محيط کشت MS............................................. 45

3-2-2 -محلول ذخيره آهن......................... 47

3-2-3- محلول ذخيره ويتامين­ها و اسيد­هاي­آمينه.... 47

3-2-4- طرز تهيه محيط کشت MS.................... 47

3-2-5 -تهيه محلول ذخيره طلا..................... 48

3-2-6 -تهيه محلول ذخيره نقره................... 48

3-3 -ضد عفوني کردنبذور......................... 48

3-4 -جمع آوري گياه براي تهيه عصاره............. 49

3-4-1 -عصاره گيري.............................. 49

3-5- تهيه نمونه جهت آناليز با دستگاه اسپکتروفوتومتري جذب اتمي ............................................... 49

3-6 -تهيه نمونه جهت آناليز با دستگا­ههاي اسپکتروفوتومتري UV-visiblو دستگاه نانوپارتيکل آناليزر..................... 50

3-7- تهيه نمونه جهت آناليز با ميکروسکوپ الکتروني روبشي 50

3-8- آناليز کاني شناسي به روش XRD.............. 50

 

فصل چهارم: نتيجه و بحث

4-1- نتايج وجود يون­هاي طلا و نقره در گياه يونجه نسبت به نمونه شاهد توسط اسپکتروفتومتري جذب اتمي................... 52

4-2 -تعيين جذب نانوذرات طلا و نقره توسط اسپکتروفتومتري UV-visible53

4-3- الگوي طيف XRD نانوذرات طلا و نقره.......... 54

4-4- نتايج تفرق ديناميکي نور ليزر توسط دستگاه نانوپارتيکل آنالايزر............................................... 55

4-4-1- تجزيه واريانس صفت مورد بررسي............ 55

4-5- نتايج ميکروسکوپ الکتروني روبشي............ 68

4-6- پيشنهادات................................. 69

فصل پنجم: منابع

منابع.......................................... 70

پيوست.......................................... 77

 

چکیده:

شوری یکی از مهمترین تنش های غیر زیستی در گیاهان زراعی است. سطوح بالای سدیم سمی و مخالف تأثیر روند متابولیسم سلولی و تعادل یونی است. البته وجود مقادیر کم سدیم در سلول برای رشد گیاه حیاتی است. ژن مقاومت به شوری SOS1، آنتی پورتر Na⁺/H⁺غشای پلاسمایی را در گندم Triticum aestivumرمز می نماید. cDNA آن 3429 نوکلئوتید طول دارد که یک پلی پپتید با 1142 اسید آمینه و وزن 126 کیلو دالتون را رمز می نماید. یکی دیگر از ژن های موثر در مقاومت به شوری ژن LTP است. به نظر می رسد که ژن LTP هنگام تنش شوری در انتقال برون سلولی لیپیدها برای تولید واکس کوتیکولی برگ نقش آفرینی می کند. انواع پروتئین های LTP گیاهی دارای تعداد اسیدهای آمینه های مختلف از 91 تا 95 هستند. فاقد تریپتوفان بوده و دارای هشت باقیمانده سیستئین در موقعیت حفاظت شده هستند.LTP ها در انجام بسیاری از فرآیندهای فیزیولوژیکی شامل تنظیم فعالیت ساختن پکتین، رسوب مواد در دیواره دانه گرده در حال توسعه، تشکیل موانع ساختاری و تحریک مسیر پیام رسانی سیستمیک و رویان زایی از سلول های رویشی نقش دارند. LTPها پروتئین های حدود 9 کیلو دالتونی هستند که به مقادیر زیاد (حدود 4% از کل پروتئین های محلول) در گیاهان عالی یافت می شوند. در این پژوهش به منظور بررسی سطح بیان ژن های LTPو SOS1 آغازگرهای forward وreverse درNCBI طراحی شدند. بذرهای گندم الموت (ژنوتیپ حساس)، ارگ (ژنوتیپ متحمل) و آجیلوپس (ژنوتیپ وحشی) کشت شده در محیط کشت هیدروپونیک، تحت تنش NaClبا غلظت 150 میلی مولار قرار گرفتند و سپس در زمان های صفر، 3، 6 و 24 ساعت پس از تنش نمونه گیری انجام شد. به منظور دقت در کار دو ظرف به عنوان شاهد در نظر گرفته شد که در هر بار نمونه برداری در ساعت های مشخص از ظرف های شاهد هم نمونه برداری انجام شد. سپس بررسی بیان با استفاده از Real Time PCRانجام شد. بررسی بیان ژن SOS1درتنش شوری ثابت کرد که با افزایش زمان در غلظت 150 میلی مولار افزایش بیان وجود دارد که دلیل بر نقش این ژن القاء شونده به عنوان یک ژن موثر در تحمل تنش شوری در گیاه و امکان استفاده کاربری از آن در انتقال به گیاهان دیگر با هدف افزایش تحمل شوری می باشد. با مقایسه میزان بیان ژن LTP بین بافت های برگ و ریشه ارقام الموت ، ارگ و ژنوتیپ آجیلوپس می توان گفت که بیشترین میزان بیان در برگ آجیلوپس در 6 ساعت و در ریشه آجیلوپس در 3 ساعت بعد از تنش وجود داشته است و در تمام موارد تفاوت معنی داری بین برگ و ریشه آنها وجود دارد. همچنین، با مقایسه بین ارقام حساس( الموت ) و مقاوم( ارگ ) و ژنوتیپ وحشی( آجیلوپس ) می توان گفت که رقم مقاوم ارگ در بیان ژن LTPعکس العمل بهتری نسبت به رقم حساس الموت نشان داده است در نتیجه این مکانیسم در ایجاد مقاومت دررقم مقاوم مفیدتر است. همچنین مشخص شد که ژن LTPدر ایجاد مقاومت به شوری در گیاهان نقش دارد. بعلاوه مقایسه میزان بیان ژن SOS1بین برگ و ریشه در ارقام الموت و ارگ و آجیلوپس نشان داد که در اینجا نیز تفاوت معنی داری بین برگ و ریشه در هر ساعت بعد از تنش وجود دارد که این تفاوت تنها در 24 ساعت بعد از تنش در برگ و ریشه ارگ معنی دار نبود.

 

کلمات کلیدی: تنش شوری، پمپ غشایی Na⁺ / H⁺، ژنLTP، ژن SOS1 ، بیان ژن.

 

فهرست مطالب

عنوان صفحه

فصل اول: مقدمه و اهداف................................ 1

1-1-مقدمه............................................. 2

1-1-1 – تنش شوری................................... 2

1-1-2- اهمیت غلات................................... 3

1-1-3- گیاه شناسی گندم............................. 4

1-1-4-گندم امر..................................... 5

1-1-5- معرفی ژن SOS1............................... 5

1-1-6- معرفی ژنLTP................................. 6

1-2- راهکارهای مقابله با شوری در عصر حاضر............. 7

1-3- اهداف پژوهش...................................... 7

فصل دوم: مروری بر پژوهش های پیشین .................... 8

2-1- خاک های شور...................................... 9

2-2- چگونه شوری برای گیاه مشکل ایجاد می کند........... 10

2-3- مکانیسم های مقابله با تنش شوری در گیاهان......... 10

2-4- مکانیسم های مولکولی تحمل به تنش شوری............. 11

2-5- انواع گیاهان بر اساس واکنش رشد به شوری........... 11

2-6- ژنهای درگیر در تحمل به تنش شوری.................. 13

2-7- مسیر ژنهای SOSدر تحمل به تنش شوری............... 14

2-8- شناسایی و نامگذاری ژن LTP........................ 14

2-9- گروه بندی LTP ها................................. 16

2-10- معرفي واکنش Real-time PCR........................... 17

2-11- معرفي روش کمي سنجي مطلق (Absolute Quantification) براي کمي کردن بيان ژن درReal-time PCR ...................................................... 19

2-12-معرفي روش کمي سنجي نسبي Relative Quantification)) براي کمي کردن بيان ژن در Real-time PCR................................................... 20

2-13- تعيين راندمان Real-time PCR......................... 20

2-14- کمي کردن نسبي بيان ژن در Real-time PCRبا فرض راندمان100 درصد...................................................... 23

2-15- کمي کردن نسبي بيان ژن با Real-time PCRدر صورت متغير بودن راندمان يا کمتر از 100 درصد.................................... 24

2-16- تاثیر تنش­شوری بر ویژگی­های بیوشیمیایی............ 24

فصل سوم: مواد و روش تحقیق ............................ 27

3-1- انتخاب ژنوتيپ گندم ............................. 28

3-2-تأیید مقاومت رقم ارگ و حساسیت رقم الموت به تنش شوری 28

3-3-کاشت بذر ها................................ 28

3-4- انتخاب نوع محيط کشت مايع ........................ 30

3-5- شرايط کنترل شده محيط گلخانه ..................... 32

3-6- اعمال تنش شوری با نمک (150 میلی مولار) ........... 32

3-7- نمونه‌گيري از بافت برگي و ریشه ................... 33

3-8- استخراجRNA از بافت برگ و ریشه .................. 33

3-9- تيمار DNAse براي حذف آلودگي ژنومي در RNA استخراج شده 35

3-10- سنتز رشته اول cDNA از RNA ..................... 36

3-11- طراحي آغازگرهاي اختصاصي به منظور بررسي بيان ژنهای LTP و SOS1 ...................................................... 38

3-12-تکثير ‌‌cDNAهای سنتز شده با استفاده از آغازگرهای LTP، 18S rRNA وSOS1بوسیله واکنش زنجيره‌اي پليمراز (PCR) .............. 40

3-13- واكنش Real time RT-PCR (Relative)براي cDNA هاي تهيه شده . 42

3-14- واكنش Real time RT-PCR ژن LTP وSOS1 و ژن‌های كنترل داخلي 18S rRNA 42

3-15- روش نرمال‌سازي بيان ژنهای LTPوSOS1 پس از واكنش Real-time PCR 44

3-16- اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم پر اکسیداز (POD) 44

3-17- اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم کاتالاز(CAT) ..... 45

3-18-آنالیز پروموتر ژن های LTP وSOS1.................. 45

فصل چهارم: نتایج و بحث................................ 46

4-1- نتایج ........................................... 47

4-1-1- استخراج RNA ................................... 47

4-1-2- تعیین کمیت و کیفیت RNA استخراج شده ......... 47

4-1-3-كمي كردن ميزان بيان ژن LTP در شرايط تنش شوری با استفاده از RT-PCRReal time .................................... 48

4-1-4-كمي كردن ميزان بيان ژنSOS1در شرايط تنش شوری با استفاده ازRT-PCR Real time.................................... 53

4-1-5- اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم پر اکسیداز (POD) 58

4-1-6- اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم کاتالاز(CAT) . 62

4-1-7- نتایج آناليز پروموتر ژن‌ SOS1و LTPدر گیاه برنج 65

4-2- بحث ............................................. 68

4-2-1- بررسی سطح بیان ژن SOS1و نقش آن در سلول ..... 70

4-2-2- بررسی سطح بیان ژن LTPو نقش آن در سلول ..... 71

4-2-3-تاثیر تنش­شوری بر ویژگی­های بیوشیمیایی ...... 73

4-2-4- نتیجه گیری کلی ............................. 74

4-3- پیشنهاد ها ..................................... 75

فصل پنجم: منابع....................................... 77

چکیده

در اين بررسي صفات مورفولوژیکی و الگوی الکتروفورزی پروتئین های کل 23 ژنوتيپ علف گندمي بلند (Agropyrone elongatum.) در دو آزمايش جداگانه يكي با مديريت بهره برداري، حفاظت شده (يك چين در سال) و ديگري با مديريت برداشت مکرر (2 چين در سال) در سال 1385 دو آزمایش جداگانه با طرح پايه بلوك هاي كامل تصادفي با سه تكرار در ايستگاه تحقيقاتي، همند آبسرد واقع در شهرستان دماوند به اجرا در آمد.براي كود دهي، قبل از كشت، تجزيه خاك بعمل آمد و از ميزان مواد معدني (فسفات، اوره و پتاس) اطلاع حاصل گرديد و بر اساس 100 كيلوگرم P₂O₅ در سال اول و 50 كيلوگرم نيتروژن N₂ در هكتار در كمبود كود برطرف گرديد. بعلت رشد ضعيف بوته در سال استقرار (1385) يادداشت برداري در اين سال انجام نشد. در آزمايش فقط از نزولات جوي استفاده شد. تجزيه واريانس آنها در قالب طرح بلوک کامل تصادفي با سه تکرار انجام شد و به روش دانکن مقايسه ميانگين در سطح احتمال 5درصد صورت گرفت. ضريب همبستگي فنوتيپي، بين ميانگين صفات محاسبه گرديد.‌ تجزيه رگرسيون براساس ميانگين داده‌هاي اصلي صفات مورفولوژيک جمعيت‌ها صورت گرفت. يک بار عمکرد بذر به عنوان متغير تابع وبقيه صفات به عنوان متغير مستقل درنظر گرفته شد. جهت انجام تجزيه به مولفه‌هاي اصلي، ماتريس همبستگي بين آنها محاسبه گردید و بر اساس آن تجزيه به مولفه‌هاي اصلي در نرم افزار minitab14 انجام شد. نتایج این بررسی نشان داد که اثر ژنوتیپ عملکرد علوفه، قابلیت هضم و ADF معنی دار بود. همچنین اثر چین برداشت بر تمامی صفات شامل درصد خاکستر، ADF، پروتئین خام، قندهای محلول، قابلیت هضم، عملکرد علوفه و وضعیت شادابی گیاه معنی­دار بود. ژنوتيپ­هاي 1755M و 774M به ترتيب با 2739 و 1762 کيلوگرم درهکتار بيشترين و کمترين عملکرد علوفه داشتند. بطور كلي در برداشت مکرر (2چین)1755M با عملكرد 1530در برداشت حفاظت شده (یک چین) و 774P4 با 4190 برتر بودند و مي توان از آنها بعنوان ارقام جديد استفاده نمود.

کلیدواژه ها:

صفات مورفولوژیکی، الگوی الکتروفورزی، Agropyrun elongatum ، تنوع ژنتیکی.

فهرست مطالب

فصل اول: كليات

1-1 مقدمه2

1-2 اهداف6

1-3 مشخصات گیاه شناسی جنس Agropyron7

1-3-1 ریشه8

1-3-2 ساقه و برگ:9

1-3-3 گل و گل انگیزی10

1-3-4 بذر و میوه:11

1-4 مشخصات گیاه شناسی Agropyrun elongatum12

فصل دوم: بررسي منابع

2-1 مروری بر منابع15

2- 1-1 گونه هاي مهم گندمي و نيازهاي اكولوژي آنها15

2-1-2 اهداف اصلاحی گراس ها:18

2-1-2-1 افزایش عملکرد علوفه:19

2-1-2-2 ویگور گیاه:19

2-1-2-3 اصلاح کیفیت علوفه:19

2-1-2-4 افزایش نسبت برگ به ساقه:20

2-1-2-5 افزایش خوش خوراکی:20

2-1-2-6 افزایش جذب اختیاری:20

2-1-2-7 کاهش مواد ضد کیفیت:21

2-1-2-8 توسعه فصل چرا:21

2-1-2-9 مقاومت به چرای دام:21

2-2 مشخصات گياهشناسي:22

2-2-5 گونه­هاي مهم علف گندمي و نيازهاي اکولوژيکي آنها:26

2-3 الکتروفورز28

2-3-1 تاريخچه استفاده از الکتروفورز28

2-3-2 اصول الکتروفورز29

2-3-3 انواع الکتروفورز30

2-3-4 اطلاعاتي در مورد مکانيسم کار با الکتروفورز33

2-3-5 استفاده از الکتروفورز در بررسي تنوع ژنتيکي35

2-3-5-1 الکتروفورز پروتئين‌ها35

2-3-6 مدل‌هاي آماري برآورد تنوع36

2-3-6-1 تجزيه به مولفه‌هاي اصلي38

فصل سوم:مواد و روش ها

3-1 مشخصات اقليمي و زراعي منطقه اجراي طرح41

3-2 مواد گياهي مورد آزمايش41

3-2 طرح آزمايشي و عمليات زراعي:43

3-2-1 اندازه گيري عملکرد و صفات زراعي43

3-2-2 اندازه گيري کيفيت علوفه:44

2-3 روش‌هاي تجزيه آماري طرح45

3-3-2 روش‌هاي آماري صفات مورفولوژي و جوانه‌زني47

3-4 مطالعات الکتروفورزي48

3-4-1 استخراج پروتئين کل گياهک48

3-4-2 الکتروفورز پروتئين‌ها49

3-5 نکات:54

3-5-1 رنگ‌آميزي پروتئين‌ها و رنگ زدايي ژل54

3-5-2 طرزتهيه مارکر55

3-6 روش کار:56

3-7 روش‌هاي آماري مورد استفاده57

فصل چهارم: تجزیه و تحلیل داده ها

4-1- بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای علف گندمی بر اساس صفات مورفولوژیکی60

4-1-1- تجزيه واريانس و مقايسه ميانگينها:60

4-1-2- تجزیه خوشهای ژنوتیپهای مورد مطالعه از نظر صفات مورفولوژیک76

4-1-3- تجزیه به مؤلفههای اصلی77

2-3- پلی مورفیسم82

2-4- الگوی تنوع83

2-4- الگوی تمایز و تجزیه خوشهای86

4-2-5- تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA)90

فصل پنجم: نتیجه گیری و پیشنهادها

5-1 نتیجه گیری93

5-2پیشنهادات96

منابع و مأخذ97

 

 

بررسی جنین‌زایی سوماتیکی در نخل خرما (Phoenix dactylifera L.)

چکیده:‌ نخل خرما گیاهی تک‌لپه، دوپایه و متعلق به خانواده Arecaceae است. به منظور غلبه بر مشکلات تکثیر رویشی و روش‌های معمول ازدیاد از طریق بذر، ریز‌ازدیادی از طریق کشت بافت مورد توجه‌ قرار گرفته است. هدف از این تحقیق، بررسی امکان کالوس‌زایی و جنین‌زایی سوماتیکی در نخل خرما با استفاده از ریزنمونه‌های مختلف می‌باشد. آزمایشات انجام شده در آزمایشگاه بیوتکنو‌لوژی دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی رامین خوزستان در سال 93-92 انجام گرفت. بدین‌منظور، ریزازدیادی با استفاده از ریزنمونه‌های مختلف شامل برگ بالغ و نارس، میوه نارس، بذر نارس، آندوسپرم، پریکارپ میوه نارس، بساک و میکروسپور در محیط‌های کشت مختلف صورت گرفت. کشت برگ رقم خضراوی در محیط کشت حاوی غلظت‌های مختلف تنظیم‌کننده‌های رشد، 2,4-D، BAP و TDZ نشان داد که بیشترین میزان کالوس‌زایی زمانی بدست‌ می‌آید که هر سه تنظیم‌کننده رشد در محیط کشت حضور داشته باشند. در 20 ترکیب تیماری‌ اعمال‌شده، ترکیب تیماری حاوی 5 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D، 2 میلی‌گرم در لیتر BAPو 4 میلی‌گرم در لیترTDZ، در لبه‌ی خارجی ریزنمونه‌های برگی و در ترکیب تیماری حاوی 5 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D، 1میلی‌گرم در لیتر BAPو4 میلی‌گرم در لیترTDZدر کناره‌های رگبرگ ریزنمونه، کالوس تشکیل گردید. با استفاده از ریزنمونه میوه نارس در محیط کشت مشابه، مشخص شد زمانی که دو تنظیم‌‌کننده رشد TDZ و 2,4-D به مقدار 5میلی‌گرم در لیتر در محیط کشت حضور داشته باشند بعد از سه هفته کالوس و بعد یک هفته چندین جنین بر روی این کالوس‌ها تشکیل می‌شود. کشت ریزنمونه‌های آندوسپرم به همراه جنین و پریکارپ در محیط کشت مشابه نیز نشان داد که حضور 2,4-D و TDZ به مقدار 5 میلی‌گرم در لیتر برای کالوس‌زایی مفید بوده است. همچنین در کشت آندوسپرم به همراه جنین، جنین‌ها رشد یافته و ابتدا ریشه‌چه و بعد از طی سه ماه ساقه‌چه مشاهده گردید. در آزمایش بررسی اکسین‌های مختلف IAA،IBA، 2,4-D و NAA بر کالوس‌زایی از ریز‌نمونه‌ی برگ رقم استعمران، نتایج نشان داد که ریز‌نمونه‌های قرار گرفته در محیط کشت حاوی NAA به مراتب کالوس‌زایی بهتری داشته است. همچنین کشت آندوسپرم و کشت پریکارپ میوه نیز در این محیط کشت حاوی اکسین‌های مختلف صورت گرفت اما هیچ واکنشی مشاهده نشد و ریز‌نمونه‌ها قهوه‌ای شده و از بین رفتند. همچنین در آزمایشی که به منظور بررسی امکان آندروژنز در خرما صورت گرفت نتایج نشان داد که در کشت بساک تحت ترکیب تیماری غلظت‌های مختلف کلشی‌سین به مدت زمان‌های مختلف، غلظت و مدت زمان‌ قرار‌گیری بساک‌ها در محیط حاوی کلشی‌سین بر میزان کالوس‌زایی تاثیر معنی‌داری داشت و در غلظت500 میلی‌گرم در لیتر و مدت زمان 12 ساعت بالاترین میزان کالوس‌زایی و در همین غلظت و مدت زمان 36 ساعت جنین‌زایی مستقیم به مقدار محدودی رخ داد. در آزمایش دیگری، کشت بساک در محیط‌های کشت MS و Y3 با ظهور نقاط سفید رنگ بر روی بساک همراه بود و 2 ماه بعد از کشت این نقاط سفید رنگ متورم شدند اما این واکنش‌ها پیشرفت چندانی پیدا نکردند. همچنین کشت میکروسپور‌ خرما نیز صورت گرفت اما تا دو ماه بعد از کشت تغییرات قابل توجهی مشاهده نگردید.

واژه‏هاي كليدي: نخل خرما، کالوس‌زایی، جنین‌زایی سوماتیکی، کشت بساک، کشت میوه نارس.

 

 فهرست مطالب

صفحه	عنوان
1	چکیده.............................................................................................................................................
	فصل اول: مقدمه و کلیات
2	1-1 مقدمه
3	1-1-1 اهمیت موضوع
4	1-1-2 فرضیات
4	1-1-3 اهداف پژوهش
5	1-2 کلیات
5	1-2-1 گیاه شناسی
6	1-2-2 نیازهای اکولوژی
6	1-2-3 خواستگاه و دامنه انتشار
7	1-2-4 خواص دارویی
7	1-2-5 موارد استفاده
8	1-2-6 مواد موثره و اجزاء اسانس
8	1-2-7 کشت بافت
9	1-2-7-1 انواع کشت بافت گیاهی
10	1-2-7-2 بررسی اثرات فاکتورهای مختلف در محیط کشت
10	1-2-7-3 نمک‌های غیرآلی
11	1-2-7-4 ویتامین‌ها
11	1-2-7-5 منبع انرژی
11	1-2-7-6 میواینوسیتول
12	1-2-7-7 عوامل فیزیکی
12	1-2-7-8 ریزنمونه
12	1-2-7-9 چگونگی انتخاب محیط کشت
13	1-2-7-10 ریزازدیادی گیاهان از طریق کشت بافت
13	1-2-7-11ریشه‌زائی
14	1-2-8 تعریف موتاسیون (جهش)
صفحه	عنوان
14	1-2-8-1 تاریخچه استفاده از موتاسیون
15	1-2-8-2 سطوح ایجاد موتاسیون
15	1-2-8-3 انواع موتاسیون
16	1-2-8-4 موتاژن (عامل جهش‌زا)
16	1-2-8-4-1 انواع موتاژن
16	1-2-8-4-2 عوامل شیمیایی جهش‌زا
18	1-2-8-4-3 مواد گیاهی مورد تیمار
18	1-2-8-4-4 اصلاح به روش موتاسیون
19	1-2-8-4-5 اهمیت موتاسیون در اصلاح نباتات.
19	1-2-8-4-6 موفقیت موتاسیون
19	1-2-8-4-7 روش‌های جدید استفاده از موتاسیون
20	1-2-8-4-8 هدف موتاسیون مصنوعی
21	1-2-9 روغن‌های اسانس
22	1-2-9-1 جداسازی و شناسایی مواد تشکیل دهنده روغن اسانسی گیاه
	فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده
23	2-1 کشت بافت
24	2-2 اثر موتاژن‌ها در ایجاد تنوع در صفات مختلف
26	2-3 اثر موتاسیون اتیل متیل سولفانات در ایجاد تنوع در سطوح مختلف
	فصل سوم: مواد و روش‌ها
32	3-1 مواد گیاهی
32	3-2 کشت بافت
32	3-2-1 تهیه محلول ذخیره محیط‌های کشت
33	3-2-1-1 تهیه محلول ذخیره ماکرو
34	3-2-1-2 تهیه محلول ذخیره عناصر میکرو
34	3-2-1-3 تهیه محلول ذخیره آهن-سدیم
35	3-2-1-4 تهیه محلول ذخیره ویتامین
35	3-2-2 تهیه محیط کشت
صفحه	عنوان
36	3-2-3 ضدعفونی نمونه‌های گیاهی
36	3-2-3-1 ضدعفونی اندام گیاه
37	3-2-4 تهیه ریزنمونه
37	3-2-5 بهینه سازی محیط کشت
37	3-2-6 بررسی نمونه‌های کشت شده
38	3-2-7 تیمارهای مورد استفاده
38	3-2-7-1 روش تهیه استوک EMS
39	3-2-7-2 روش اعمال تیمارهای EMS در گیاه کشت بافتی
39	3-2-7-3 روش اعمال تیمارهای EMS در مزرعه
39	3-2-7-4 روش شستشوی تیمارها
40	3-3 استخراج مواد موثره گیاهی
40	3-3-1 روش‌های استخراج اسانس
40	3-4 آنالیز اجزاء اسانس
41	3-5 آنالیزهای آماری
	فصل چهارم: نتایج و بحث
42	4-1 بررسی نمونه‌های کشت بافتی
45	4-2 تاثیر EMS برروی خصوصیات مرفولوژیکی گیاه
46	4-2-1 اثر دوز EMS و زمان برروی طول ساقه
47	4-2-2 اثر دوز EMS و زمان برروی طول ریشه
47	4-2-3 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد برگ
48	4-2-4 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد ریشه جانبی
49	4-2-5 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد جوانه
50	4-2-6 اثر دوز EMS و زمان برروی متوسط طول برگ
51	4-2-7 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد ریشه
51	4-3 ضریب همبستگی بین صفات و خصوصیات مورد بررسی
52	4-4 استخراج اسانس
52	4-4-1 آنالیز و شناسایی کمی و کیفی اجزای موجود در اسانس
صفحه	عنوان
53	4-4-2 نتایج آزمایشگاهی
53	4-4-3 نتایج مربوط به طیف کروماتوگرام گازی گیاه
54	4-4-4 ترکیبات تشکیل دهنده اسانس
	فصل پنجم: نتیجه‌گیری
55	5-1 بحث
55	5-1-1 کشت بافت گیاهی..............................................................................................................
56	5-1-2 اثرات موتاژن EMS .........................................................................................................
60	5-2 نتیجه‌گیری..............................................................................................................................
61	5-3 پیشنهادات...............................................................................................................................
62	فهرست منابع فارسی.......................................................................................................................
64	فهرست منابع انگلیسی....................................................................................................................
71	پیوست‌ها.........................................................................................................................................
75	چکیده انگلیسی...............................................................................................................................

 

فهرست جداول
صفحه	عنوان جدول
33	جدول 3-1 ترکیبات محیط کشت پایه MS...............................................................................
34	جدول 3-2 جدول عناصر پرمصرف MS با غلظت X10.........................................................
34	جدول 3-3 جدول عناصر کم مصرف MS با غلظت X100....................................................
35	جدول 3-4 محلول ذخیره آهن، ویتامین و اسیدهای آمینه با غلظت X100...............................
41	جدول 3-5 شرایط دستگاه GC-MS.......................................................................................
46	جدول 4-1 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی طول ساقه گیاه نعناع فلفلی...
47	جدول 4-2 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی طول ریشه گیاه نعناع فلفلی..
47	جدول 4-3 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی تعداد برگ در ساقه گیاه.......
48	جدول 4-4 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی تعداد ریشه جانبی گیاه.........
49	جدول 4-5 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی تعداد جوانه گیاه...................
50	جدول 4-6 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی متوسط طول برگ.................
51	جدول 4-7 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی تعداد ریشه گیاه....................
52	جدول 4-8 ضریب همبستگی بین صفات و خصوصیات مورد بررسی در گیاه نعناع فلفلی......
53	جدول 4-9 درصد اسانس و روش استخراج..............................................................................
54	جدول 4-10 میزان مواد موثره موجود در اسانس نعناع فلفلی....................................................

 

 

 

 

 

 

 

فهرست شکل‌ها و پیوست‌ها
صفحه	عنوان شکل
5	شکل 1-1 شمائی از گیاه کامل نعناع فلفلی................................................................................
17	شکل 1-2 ساختار شیمیایی مواد جهش‌زا...................................................................................
53	شکل 4-1 کروماتوگرام گازی اسانس نعناع فلفلی......................................................................
58	شکل 5-1 نمای از مراحل تاثیر EMS برروی گیاه کشت بافتی................................................
59	شکل 5-2 مراحل رشد گیاهان مورد تیمار موتاژن در محیط کشت...........................................
59	شکل 5-3 تیمار اعمال شده در مزرعه........................................................................................
71	شکل الف-1 مراحل ضدعفونی گیاه...........................................................................................
71	شکل الف-2 تهیه ریزنمونه.........................................................................................................
72	شکل الف-3 مراحل انجام کار در اتاقک کشت..........................................................................
72	شکل الف-4 نمای از دستگاه انکوباتور......................................................................................
72	شکل الف-5 اعمال EMS در محیط کشت...............................................................................
75	شکل الف-6 اعمال EMS در مزرعه.........................................................................................
73	شکل الف-7 شستشوی تیمارهای کشت بافتی از EMS...........................................................
73	شکل الف-8 شستشوی بوته‌های تیمار شده در مزرعه...............................................................
74	شکل الف-9 نمای از بوته‌های تیمار شده در مزرعه..................................................................
74	شکل الف-10 مراحل اسانس‌گیری............................................................................................
74	شکل الف-11 نمای از دستگاه روتاری......................................................................................

 

 

 

 

فهرست نمودارها
صفحه	عنوان نمودار
42	نمودار4-1 طول ساقه.................................................................................................................
43	نمودار4-2 طول ریشه.................................................................................................................
43	نمودار4-3 تعداد برگ در ساقه...................................................................................................
44	نمودار4-4 تعداد ریشه جانبی.....................................................................................................
44	نمودار4-5 تعداد جوانه در ساقه.................................................................................................
45	نمودار4-6 متوسط طول..............................................................................................................
46	نمودار4-7 اثر غلظت EMS برروی طول برگ در گیاه نعناع فلفلی..........................................
48	نمودار4-8 اثر غلظت EMS برروی تعداد برگ در ساقه گیاه نعناع فلفلی................................
49	نمودار4-9 اثر غلظت EMS برروی تعداد ریشه جانبی گیاه نعناع فلفلی..................................
50	نمودار4-10 اثر غلظت EMS برروی تعداد جوانه گیاه نعناع فلفلی.........................................

 

 

 

 

فهرست علامت‌ها و اختصارها

معادل فارسی	معادل انگلیسی	علامت
اتیل متیل سولفانات	Ethyl Methane Sulfonate	EMS
کروماتوگرافی گازی توام با طیف سنجی جرمی	Gas Chromatography Mass Spectroscopy	GC-MS
اتیل اتان سولفانات	Ethyl Ethane Sulfonate	EES
بنزیل آدنین	Benzyladenine	BA
بنزیل آمینوپورین	Benzylaminopurine	BAP
ایندول-3- استیک اسید	Indole3-acetic acid	IAA
ایندول-3- بوتیریک اسید	Indole3-butric acid	IBA
نفتالین استیک اسید	1-Naphthaleneacetic acid	NAA

 

 

 

چکیده

 

نعناع فلفلی با نام علمی Mentha piperitaیکی از انواع گیاهان دارویی می‌باشد که به دلیل تولید اسانس‌های با ارزش در صنایع داروسازی و بهداشتی استفاده‌های فراوانی دارد. استفاده از مواد موتاسیون‌زا از قبیل EMS می‌تواند تغییرات جهش‌زای نقطه‌ای در گیاه ایجاد کند که در نهایت منجر به ظهور فنوتیپ جدید در این گیاه با ارزش شوید. لذا این پژوهش با انجام تیمارهای متعدد از غلظت‌های مختلف EMS روی سرشاخه‌های رشد یافته در محیط کشت MSبدون هورمون و با غلظت‌های 0/0% (به عنوان شاهد)، 05/0% و 01/0% و 005/0% از EMS و مدت زمان‌های مختلف (24 و48 ساعت) و همچنیندر قسمت مزرعه‌ای نیز از همین غلظت‌ها و زمان‌ها استفاده شد. ارزیابی‌ در داخل لوله آزمایش و مزرعه بطور همزمان انجام گرفت. پس از انتفال و رشد و نمو نمونه‌ها در شرایط in vitro، تیمارها با ماده جهش‌زا اتیل متان سولفانات مورد بررسی قرار گرفتند. فاکتورهای مختلف مورفولوژیکی از قبیل طول ساقه و تعداد ریشه رونده جانبی در سطح 1% و تعداد برگ و تعداد جوانه در ساقه در سطح 5% پاسخ معنی‌داری را نشان دادند. نتایج اين پژوهش نشان داد كه استفاده از مواد جهش‌زا در محیط کشت MS نقش بسزایی در تغییر فنوتیپی این گیاه دارویی دارد. غلظت 01/0%EMS بهترین نتیجه معنی‌دار را در سطح 1% و از کشت ریزنمونه‌های که شامل جوانه‌های جانبی و انتهایی بوده‌اند به‌دست آورده که برروی خصوصیاتی همچون طول ساقه، تعداد برگ و تعداد جوانه جانبی اثر داشت. آنالیز اسانس تیمارها نیز انجام شد که نتیجه آن بی‌اثر بودن این ماده اتیل متان سولفانات روی مواد اجراء اسانس این گیاه بوده است.

 

کلمات کلیدی: اتیل متیل سولفانات (EMS)، اجزاء اسانس، کشت درون شیشه‌ای، محیط کشت MS، نعناع فلفلی (Mentha piperita).

 

 

فصل اول

مقدمه و کلیات

 

1-1 مقدمه:

گیاهان به عنوان یکی از اجزاء طبیعت، از دیرگاه پشتوانه غنی نیازهای بشری بوده‌اند و می‌توان با اطمینان گفت تا زمانی که انسان در این کره خاکی به سر می‌برد، به گیاهان نیاز دارد (سلیمان زاده، 1377).

در بحث گیاهان دارویی، محدودیت‌های کاشت و نگهداری آن‌ها متعدد می‌باشد که از آن جمله می‌توان به کوتاه بودن فصل کاشت و یا برداشت بعضی از گونه‌های گیاهی، کمبود زمین‌های مناسب جهت داشت، ناچیز بودن مواد موثره حاصل از گیاه و غیره اشاره کرد (ثقه الاسلام و موسوی، 1385).

یکی از راه‌های رفع این محدودیت‌ها کشت بافت گیاهی[1] است. تکنیک‌های کشت بافت گیاهی درحال حاضر به عنوان یک ابزار قوی جهت رفع مشکلات اساسی و کاربردی بیولوژی گیاهی درآمده است.

استفاده از گیاهان به عنوان دارو از زمان‌های خیلی دور در معالجه انسان و دام مرسوم بوده است. در حال حاضر حدود یک سوم داروهای مورد استفاده دارای منشاء گیاهی می‌باشند. کشورهای آسیایی بخصوص هند، چین و ایران سابقه بسیار طولانی دراین زمینه دارند. این گیاهان مواد زیستی بخصوص و فعال با مقادیر بسیار کم تولید می‌کنند که تحت عنوان متابولیت‌های ثانویه نام‌گذاری می‌شوند.در عصر جدید، دانشمندان علوم گیاهی با استفاده از آخرین تکنیک‌های عملی کشت بافت گیاهی، توانسته‌اند از انواع گیاهان ترکیب‌های بسیار مفیدی را جهت مداوای بیماری‌های سخت و غیر قابل مداوا و موارد استفاده دیگر، بدست آورند. در طی چند دهه اخیر روش‎های متفاوتی با استفاده از بیوتکنولوژی[2] درزمینه پرورش محصولات گیاهی برتر ابداع شده است که از جمله آن‌ها می‌توان روش‌های ایجاد گونه‌های جهش یافته[3] و پلی پلوئید[4] را نام برد.

گیاهان دارویی فراوانی در کشور ما می‌رویند که بسیاری از آن‌ها از جمله نعناع فلفلی دارای طیف وسیعی از خواص دارویی می‌باشند. برهمین اساس بررسی و مطالعه گیاهان دارویی ایران با استفاده از ابزارهای امروزی ضروری به نظر می‌رسد. کشت سلول و بافت که به عنوان کشت درون شیشه‌ای[5] و یا کشت استریل نیز مطرح می‌شود، ابزاری مهم در مطالعات پایه و کاربردی بوده و دارای کاربردهای تجاری است (رجب‌بیگی و همکاران، 1385؛سونانداکوماری و همکاران[6]،2003). یکی از این کاربردها امکان ایجاد گیاهان ترانسژنیک با وارد کردن DNA تقریبا از هر منبع دیگری می‌باشد. شاید اولین قدم در زمینه کشت بافت گیاهی در سال 1756 توسط هنری لوئیس داهامل برداشته شد، زمانی که وی شاهد تشکیل کالوس[7] در حین مطالعه مواد التیام دهنده زخم‌های گیاهی بود (غضنفری[8]، 1994).

اساس تئوری کشت بافت گیاهی توسط گتلیت هابرلنت از آکادمی علوم آلمان در سال 1902، بعد از آزمایش‌های وی روی کشت تک سلول‌ها پیشنهاد گردید (هابرلنت[9]، 1902). توسعه روش‌های کشت بافت و زیست‌شناسی مولکولی برای تبادل DNA بین موجودات زنده غیر خویشاوند این امکان را می‌دهد که ژن‌های جدیدی از موجودات زنده خارج از سلسله گیاهی به درون گیاهان گیرنده وارد شوند. لذا مطالعه حاضر می‌تواند کمکی جهت بررسی و واکنش‌های گیاه نعناع فلفلی نسبت به تکنیک‌های مختلف کشت بافت و باززائی این گیاه از طریق کشت بافت و اثر مواد جهش‌زائی همچوناتیل متان سولفانات[10] (EMS) باشد، تا محققین دیگر بتوانند به مطالعه خواص دارویی یا تغییرات لازم در مواد موثره یا فعال (متابولیت‌های ثانویه) و یا مطالعات انتقال ژن در این گیاه بپردازند.

 

1-1-1 اهمیت موضوع

برای انجام کشت بافت نعناع فلفلی (Menthapiperita) از بخش‌های مختلف گیاه مانند ریشه، برگ، ساقه و گره استفاده شد (سونانداکوماری و همکاران، 2003؛ ساجانا و همکاران[11]، 2011). با توجه به اینکه روش معمول اصلاح و بهبود تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان دارویی شامل کاشت آن‌ها در مزرعه و سپس برداشت و استخراج این مواد به روش‌های شیمیایی و غیره با مشکلات متعددی نظیر شرایط محیطی و زراعی، صرف زمان، هزینه و استفاده نیروی کار زیاد و همچنین خطرنابودی برخی از گیاهان دارویی کمیاب روبرو است، استفاده از روش‌های نوین از جمله کشت درون شیشه‌ای(invitro) ضرورت می‌یابد به همین منظور اولین بار در سال 1976 توسط زنیک تکنیک کشت سوسپانسیون سلول‌های گیاهی حاوی متابولیت‌های ثانویه انجام گرفت. البته در ارتقاء بیوسنتز متابولیت‌های دارویی در شرایط درون شیشه‌ای اغلب، گیاهانی انتخاب می‌شوند که بازده تولید متابولیت‌های با ارزش در آن‌ها بالا باشد (باقری و صفاری، 1387).

نعناع فلفلی به عنوان یک گیاه دارویی شناخته می‌شود (امیدبیگی، 1384،1389). تاکنون مطالعات زیادی در مورد تعیین مواد موثره نعناع فلفلی صورت گرفته است (کاظم الوندی و شریفان، 1388). موارد مصرف و خواص دارویی آن نیز به خوبی مطالعه شده است اما مطالعات کشت بافت و ایجاد جهش زیاد نبوده است. با توجه به اینکه تکثیر این گیاه از طریق بذر مشکل است (بدلیل بذور کم و نابارور)، بهترین و سریع‌ترین راه برای داشتن گیاه جهت مصارف صنعتی، کشت بافت است. همچنین با در نظر گرفتن اهمیت و خواص دارویی این گیاه، مطالعات کشت بافت و بهینه‌سازی محیط کشت جهت اهداف مختلف برای این گیاه ضرورت دارد.

 

1-1-2 فرضیات

1- کشت بافت یکی از راه‌های سریع در ازدیاد انبوه نعناع فلفلی می‌باشد.

2- نعناع فلفلی در محیط کشت همواره در دسترس برای اعمال هر گونه اعمال تیمار از قبیل جهش می‌باشد.

3- ایجاد جهش نقطه­ای تا چه میزانی می‌تواند بر روی مواد موثره و میزان اسانس تغییر ایجاد نماید.

 

1-1-3 اهداف پژوهش

1- آشنایی با تکنیک کشت بافت گیاه دارویی نعناع فلفلی و تکثیر آن در داخل شیشه.

2- بدست آوردن مقدار قابل توجه گیاه در حال رشد برای اعمال جهش نقطه‌ای در نعناع فلفلی.

3- بررسی تغییر در میزان مواد موثره گیاه در غلظت‌های مختلف ماده جهش‌زای EMS

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1-2 کلیات

1-2-1 گیاه شناسی

نعناع فلفلی با نام علمیMenthapiperitaL.و بـا نـام عمومیPeppermintازخانواده نعناعيان یکگیاه علفی چند ساله است که در رده‌بندی گیاهی از تیرهLamiaceae راستهLamialseو ردهRosidaeمی‌باشد (فوستر[12]، 1996؛پیرس[13]، 1999). برگ‌های آن بیضوی ، متقابل ، نوک تیز ،دندانه‌دار کمی پوشیده از کرک به درازای ۷-۴ سانتی‌متر و به عرض ۳-۲ سانتی‌متر است (فلمینگ[14]، 1998). گل‌ها کامل نامنظم، اکثراً دوجنس یا هرمافرودیت و مجتمع بهصورت گروهی در روی ساقه و در انتهای ساقه ظاهر می‌شوند گل‌ها در ماه‌هایمرداد و شهریور ظاهر می‌شوند (امیدبیگی، 1384،1389). رنگ آنها گلی روشن یا کم و بیش ارغوانی مایلبه بنفش می‌باشد و به تعداد زیاد نیز در مجاورت یکدیگر به نحوی مجتمع می‌شوند که مجموعاً در قسمت انتهای ساقه‌ها ، به صورت سنبله‌هایی با شکل ظاهری، بیضوی و نوک تیز جلوه می‌کند (شکل1-1). برخی از شاخه‌های این گیاه عقیم و عاری ازگل باقی می‌ماند. عمر گل‌ها بسیار کوتاه و مدت کمی پس از تشکیل از گیاهجدا می‌شود، میوه کپسول ، کوچک و به رنگ قرمز تیره است (امیدبیگی، 1384،1389).

 

 

شکل1-1شمائی از گیاه کامل نعناع فلفلی

 

از جمله ویژگی‌های تشریحی نعناع فلفلی، کرک‌های ترشحی اسانس در آن‌ است که دارای پایه یک یاچند سلولی منتهی به یک برجستگی ۴ تا ۸ سلولی و حتی بیشتر می‌باشد . اسانس ترشحشده نیز معمولاً خارج از جدار سلولزی ، در زیر کوتیکول جمع می‌گردد و اینخود باعث می‌شود که بشره در همان ناحیه کمی متورم جلوه نماید (امیدبیگی، 1384،1389).

اسانس گیاهنعناع فلفلی در ابتدای رویش گیاه در غده‌های پیکررویشی گیاه ساخته و ذخیرهمی‌شود . تعداد کل غده از حدود ۱۰۰ غده برای برگ‌های به طول ۲ میلی‌متر تاحدود ۷۵۰۰ غده برای برگ‌های ۲۵ میلی‌متری نعناع فلفلی متغیر است. برگ‌ها ۲تا ۷/۲ درصد و گل‌ها ۴ تا 6درصد اسانس دارند. ساقه‌ها معمولاً فاقد اسانسمی‌باشند. به‌طور متوسط مقداراسانس در اندام‌های هوایی گیاه ۱ تا 5/1 درصدگزارش شده است (امیدبیگی، 1384،1389).

 

1-2-2 نیازهای اکولوژیکی

نعناع فلفلی در طول دوره رویش به هوای نسبتا گرم و تابش نور کافی نیاز دارد. در طول دوره رویش نیاز به آب کافی دارد. اين گياه در مناطقي كه داراي زمستان‌هاي ملايم (حداقل دما 8 - درجه سانتي‌گراد) و خاك با PH بين 5-8 باشد قابل كشت است . به طور كلي خاك‌هاي اسيدي و زهكشي شده براي كشت نعناع فلفلي مناسب هستند، اين گياه زمستان را بصورت ركود به سرمي‌برد و در فصل بهـــار مجدداً رشد كرده و سرشاخه مي‌دهد (فصلنامه پژوهشی،1383).

 

1-2-3 خاستگاه و دامنه انتشار

گیاهان تیره نعناع طوری در کره زمین پراکنده شده‌اند که در اغلب نواحی یافتمی‌شوند ، ولی بیشینه انتشار آنها در منطقه مدیترانه است . امروزه درکشورهای مختلف جهان ، متجاوز از چند هزار تن اسانس در سال ، از این گیاهانتهیه می‌شود و این خود درجه اهمیت و توسعه کشت آن‌ها را در نقاط مختلف کرهزمین نشان می‌دهد. اسانس مانت کشور انگلستان که به اسانس میچام موسوم است ،بهترین نوع آن به حساب می‌آید (زرگری، 1368-1380). در مورد منشاء این گیاه اختلاف نظرهاییوجود دارد. عده‌ای از گیاه شناسان آسیا را منشاء نعناع می‌دانند، درحالی‌که عده‌ای دیگر از محققان منشاء آن را انگلیس دانسته و معتقدند که اینگیاه در قرن هفدهم، در انگلیس به وجود آمده است (امیدبیگی 1389).

 

 

 

 

1-2-4 خواص دارویی

در حال حاضر از اسانس نعناع گونهpiperitaهمراه دیگر گونه‌هایگیاهی در ساخت داروهای گیاهی زیر که در کشور ایران به ثبت رسیده است،استفاده می‌شود. برای مثال قرص مکیدنی آلتادین (موارد مصرف: التهاب‌هایمخاط گلو و دهان)، قرص‌های روکش‌دار آلیکوم (موارد مصرف: پایین آورندهفشار و چربی خون، ضد تصلب شرایین، ضد نفخ، اشتها آور)، گرانولپلانتاژل (موارد مصرف: اسهال‌های ساده)، قرص درگلیس (موارد مصرف: درمانزخم معده و زخم اثنی عشر، گاستریت و نفخ معده)، پودر کارامین (مواردمصرف: اختلال‌های هضم همراه نفخ)، شربت کاراوی میکسچر (موارد مصرف: دلدرد نوزادان و اختلالات گوارشی در کودکان) ، قرص مکیدنی ماسومنت (مواردمصرف: التهاب گلو در سرماخوردگی‌ها و سرفه)، قرص جویدنی مانت (مواردمصرف: اسپاسم‌های دستگاه گوارش، نفخ معده و به عنوان خوشبو کننده دهان)،ژل منتاژل (موارد مصرف: قارچ کچلی لای انگشتان پا و کشاله ران، ضد خارشو سوزش، گزیدگی‌ها و سوختگی‌های سطحی) (میرحیدر، 1377؛فون ویک و وینک، 2008).

 

1-2-5 موارد استفاده

بيشترين مصرف نعناع فلفلي به منظور تهيه اسانس است (امیدبیگی، 1384). اسانس این گیاه در طب سنتی مورد استفاده قرار می‌گيرد (ویکرانت و همکاران[15]، 2006). اين اسانس خاصیت ضد قارچی (بشهوس و ترونتون[16]،1997؛پاندی و همکاران[17]، 1996) و ضد میکروبی دارد (امیدبیگی، 1389؛زمانی‌زاده و همکاران، 1379؛خان و همکاران[18]، 2003؛موررای[19]، 1995؛موریرا و همکاران[20]، 2005). اسانس نعناع فلفلی در صنایع غذايي، بهداشتي، آرايشي، شیرینی پزی، تولید ادویه و نوشابه سازي مصرف شده و از طعم آن در بهبود مزه داروهای بدمزه استفاده مي‌گردد (میرحیدر، 1377).

در محلول‌های شستشوی دهان و گلو و خمیر دندان به خاطر خاصیت ضد باکتریایی منتول موجود در اسانس نعناع فلفلی، از آن استفاده می‌شود (زمانی‌زاده و همکاران، 1379).از اين گياه در تركيب داروهاي گياهي توليد شده در كشور از جمله آلتادين، ماسومنت، قطره نعناع، منتاوآليكوم استفاده شده است.

 

---

 

 

 

چکیده
مقدمه علایم اختصاری
فصل اول: بررسی منابع
1-1- بیوتکنولوژی پروتئین­های دارویی	1
2-1- کلون­کردن ژن	3
1-2-1- ابزار و عوامل کلون­کردن ژن	4
1-1-2-1- آنزیم­های برشی	4
2-1-2-1- آنزيم DNA لیگاز	5
2-2-1- وکتورهای کلونینگ	6
1-2-2-1- پلاسمیدها	10
3-1- سیستم­های بیان کننده مورد استفاده در تولید پروتئین­های نو­ترکیب	11
1-3-1- باکتری E. coliبعنوان میزبان بيان کنندة پروتئین­های نو­ترکیب	15
2-3-1- وكتور بيان­كننده	15
1-2-3-1- پروموتر	16
1-1-2-3-1- پروموتر T7 و سیستم بیانی PET	17
2-2-3-1- منشاء همانند­سازی	18
3-2-3-1- ماركر انتخابي	18
4-2-3-1- خاتمه دهنده رونويسي	19
5-2-3-1- سيگنالهاي ترجمه يكي از عوامل مؤثر در افزايش بيان	19
6-2-3-1- انتخاب كدون	20
4-1- مسائلي در مورد توليد پروتئين­هاي نو­ترکيب در اشرشياکلي	21
1-4-1- پايداري پلاسميد	21
2-4-1- عدم حذف متيونين در انتهاي N ترمينال پروتئين نو­ترکيب	22
3-4-1- بار متابوليکي	23
4-4-1- مشکلات بيان پروتئين­هاي نوترکيب در سيتوپلاسم باکتري اشرشياکلی.	23
5-1- سيستم ایمنی ذاتی و اكتسابي	25
6-1- سایتوکاین­ها	25
1-6-1- فاکتور نکروز کننده تومور (TNF)	26
1-1-6-1- ويژگي­هاي ژن و مولكول TNFα	27
2-1-6-1- ويژگي هاي ساختاري پروتئين TNF	28
3-1-6-1- ساختار گیرنده TNF و سوپرفاميلي آنها	29
4-1-6-1- نقش بيولوژيكي TNFα	31
5-1-6-1- مكانيسم عمل	31
7-1- TNF-α و نقش آن در برخي از بيماري­های تحلیل عصبي	34
1-7-1- TNF و بیماری آلزایمر(AD)	34
2-7-1- TNF و ایسکمی مغزي	35
3-7-1- TNF و بیماری پارکینسون	36
دستگاه­هاي مورد استفاده
فصل دوم : مواد و روش­ها
1-2- نمونه­گيري از خون انسان	38
2-2- استخراج ­RNAي كل از خون	38
1-2-2- وسايل لازم	38
2-2-2- روش کار	39
3-2- سنتز cDNA	40
1-3-2- روش کار	41
4-2- کلونینگ cDNA­ ی کد کننده TNF-α­ی انسان	41
1-4-2- طراحی جفت پرایمرها	41
2-4-2- واکنش PCR	42
1-2-4-2- الكتروفورز با ژل آگاروز	43
1-1-2-4-2- مواد و وسایل مورد نیاز	43
2-1-2-4-2- روش کار	43
3-1-2-4-2- رنگ­آميزي ژل آگارز با اتيديوم برومايد	43
3-4-2- خالص­سازی محصول PCR با استفاده از كيت	44
4-4-2- کلونینگ cDNA کد کننده TNF-α در وکتور pBR322	45
1-4-4-2- انجام واکنش اتصال	47
2-4-4-2- ترانسفورماسیون محصول اتصال به باکتری	47
3-4-4-2- میزبان باکتریایی E. coli	47
4-4-4-2- کشت و نگهداری باکتری­ها	48
5-4-4-2- تهيه باكتريهاي مستعد (Competent bacteria) براي پذيرش DNA پلاسميديخارجي	49
6-4-4-2- انتقال پلاسمید به درون سلول­های مستعد باکتریایی	50
7-4-4-2- غربال كردن كلون‌هاي واجد پلاسميد نو­تركيب و کشت کلونی باکتریایي.	50
8-4-4-2- استخراج DNA پلاسميدينو­ترکیب	51
9-4-4-2- تایید کلنی­های حاوی اینسرت توسط PCR و آنزیم­های برشی	51
5-4-2- كلونينگ cDN­ی كد­كننده TNF-α در حامل pET21	52
1-5-4-2- برش حامل pET21	52
2-5-4-2- اتصال ­cDNAی TNF-α به حامل pET21	54
6-4-2- انتقال پلاسمید نوترکیب به باكتريE.coli سویهBL21(DH3) برای بررسی پروتئین نوترکیب	54
1-6-4-2- انتخاب کلون­هاي ترانسفورم شده و کشت کلنی­ها	54
5-2- روش­های مربوط به بررسی بیان پروتئین hTNFα نو­ترکیب	55
1-5-2- القاء بیان پروتئین نو­ترکیب	55
2-5-2- تهیه نمونه پروتئینی جهت SDS-PAGE	55
1-2-5-2- SDS-PAGE	56
2-2-5-2- مواد لازم جهت SDS-PAGE	57
3-2-5-2- روش آزمایش	57
3-5-2- وسترن بلاتينگ	59
6-2- نرم­افزارها	61
فصل سوم : نتایج
1-3- نمونه­های خون	62
2-3- استخراج RNA کل از خون	62
3-3- سنتز cDNA كل	63
1-3-3- تکثیر توالی کد­کننده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای انسانی	63
4-3- کلون­سازی توالی کد کننده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای انسانی تکثیر شده با روش PCR در پلاسمید pBR322 و ساخت پلاسمید نو­ترکیب pBRtnf	64
5-3- ساخت پلاسمید بیان کننده نو­ترکیب pET21tnf	67
6-3- بررسی بیان پروتئین نو­ترکیب در E. coli	71
7-3- مقایسه اثر غلظت­های مختلف IPTG در میزان بیان پروتئین	72
8-3- بررسی میزان بیان پروتئین در زمان­های مختلف بعد از القاء	73
9-3- وسترن بلاتینگ	74
فصل چهارم : بحث
4-1- بحث	75
فصل پنجم : نتیجه­گیری و پیشنهادات
نتیجه­گیری و پیشنهادات	80
منابع مورد استفاده	81

 

فهرست جداول عنوان

جدول 1-1 : برخی از پروتئین­های نو­ترکیب موجود در بازار دارویی.............................3

جدول 2-1 : معایب و مزایای سیستم­های بیان کننده مختلف جهت تولید پروتئین­های نوترکیب.......12

جدول 3-1 : تعدادي از پروموترهاي مورد استفاده براي بيان ژن در E. coli..............17

جدول 1-2 :ترکیبات مورد نیاز در سنتز cDNA.........................................................40

جدول 2-2 : ترکیب واکنش PCR(مقادير بر حسب ميكروليتر)...................................42

جدول 3-2 : واکنش برش آنزيمي.................................................................................46

جدول 4-2 : ترکیبات واکنش اتصال TNF-αو pBR322......................................47

جدول 5-2 : فهرست سويه‌هاي E. coli استفاده شده در اين تحقيق..........................47

جدول 6-2 : ترکیبات محیط کشت LB.......................................................................48

جدول 7-2 : مخلوط واكنش براي برش آنزيمي............................................................54

جدول 8-2 : اجزاي واكنش اتصال................................................................................54

جدول 9-2 : تهیه12میلی­لیتر محلول ژل پایین با غلظت 10 در صد...........................57

جدول 10-2 : تهیه5میلی لیتر محلول ژل بالا با غلظت 4 در صد...............................57

جدول 11-2 : ترکیبات بافر نمونه (5x).......................................................................57

جدول 12-2 : ترکیبات بافرالکترود (بافر مخازن).........................................................57

 

فهرست اشكال

شکل 1-1 : اجزاء اوليه و اصلي وكتور بيان­كننده ژن درE. coli......................................16

شکل 2-1: نقشه كروموزوم MHC انسان و ژن hTNFα................................................27

شکل 3-1 : ساختار كريستالي TNFα بر گرفته از Protein Data Bank....................29

شکل 4-1 : شکل 4-1 مسیر سیگنالی TNFR1...............................................................33

شکل 1-2 : نقشه فیزیکی پلاسمید pBR322 (اقتباس از فرمنتاس)................................46

شکل2-2 : نقشه فیزیکی پلاسمید pET21a (+) (اقتباس از فرمنتاس)...........................53

شكل 1-3 : چهار نمونه خون انسان سالم..........................................................................62

شکل 2-3 : الکتروفورز RNA کل استخراج شده از 4 نمونه خونبا استفاده از کیت......63

شکل 3-3 : الکتروفورز محصول تکثیر شده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای نو­ترکیب با روش PCR و با پرایمرهای R و F بر روی ژل آگارز......................................64

شکل 4-3 : نقشه پلاسمید نوترکیبpBR322tnf ..........................................................65

شکل 5-3 : الگوی برش نخورده پلاسمیدهای نو­ترکیب pBRtnf در مقایسه با pBR322 فاقد cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفا.....................................................................66

شکل 6-3 : الکتروفورز محصول واکنش PCR بر روی پلاسمیدهای نو­ترکیب بر روی ژل آگارز.........67

شكل 7-3 : نقشه پلاسمید نوترکیب pET21tnf.............................................................68

شکل8-3 : نتایج الکتروفورز محصول PCRپلاسمید نو­ترکیب pETtnf با پرایمرهای R و F بر روی ژل آگارز...................................................................................................................................................69

شکل 9-3 : الکتروفورز محصول پلاسمید نوترکیب pET21tnf برش يافته با آنزیم های NdeI، HindIII و بریده شده با دو آنزیم NdeI- HindIIIبر روی ژل آگارز..............70

شکل10-3 : توالی نوکلئوتیدی ژن TNF و اسیدآمینه­ای ترجمه شده آن از یکی از کلون های نو­ترکیب به دست آمده، pET21tnf...............................................................71

شکل 11-3 : بیان ژن TNF-α انسانی در BL21E. coli.............................................72

شکل 12-3 : مقایسه غلظت­های مختلف IPTG بر روی بیان..........................................73

شکل 13-3 : مقایسه بیان پروتئین در زمان­های مختلف بعد از القاء..................................73

شکل 14-3 : نتایج وسترن بلاتینگ بیان پروتئین نوترکیب در غلظت­های 0625/0، 125/0، 5/0و 1 میلی­مولار..74

 

علايم اختصاري:

LB: Luria Bertani

NK cell: Natural killer cell

OD: Optical Density

TNF: Tumor Necrosis Factors

TAE: Tris-acetate EDTA

SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophoresis

RT-PCR: Reverse transcription polymerase chain reaction

rhTNF-α: Recombinant human Tumor Necrosis Factor alpha

MCS: Multiple cloning site

LPS: Lipopolysaccharide

IPTG: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

IL: Interleukin

INF: Interferon

EDTA: Ethylene diamine tetra acetic acid

DW: Distilled water

APS: Ammonium persulfate

MS: Multiple Sclerosis

TEMED: N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine or N,N,N,N-Tetramethyl-1,2-diaminoethan

TE: Tris EDTA

TM: Melting temperature

RCLB: Red Cell Lysis Buffer

CTL : Cytotoxic T cell

X-gal: bromo-chloro-indolyl-galactopyranoside

MHC: Major Histocompatibility Complex

AD: Alzheimers disease

PD: Parkinsons disease

LT: Lymphotoxin

TLR: Toll-like receptor

FADD: Fas-Associated protein with Death Domain

RIP: Receptor Interacting Protein

 

 

چکیده

سایتوکاین ها خانواده اي از فاكتورهاي رشد هستند که توسط سلول های سيستم ایمنی ترشح می شوند. این خانواده شامل اینترلوکین ها (IL)، اینترفرون ها (IFN)، فاکتور نکروز کننده تومور (TNF)، کموکاین ها و سایر فاکتورهای رشد میباشند. فاکتور نکروز کنندۀ تومور، بعنوان يك مولکولی با خصوصیات آنتی توموری است که عمدتاً توسط ماکروفاژهاي تحريك شده با باکتری ترشح میشود. عليرغم ابنكه مقادير محدودي TNF-α از منابع طبیعی آن بدست مي آيد اما مقادیر زیادی از فرم محلول آن (مورد نیاز برای مطالعات ساختاری و عملکردی) را میتوان به آسانی توسط تکنولوژی DNA نوترکیب به دست آورد. بنابراين ترجیح داده میشود براي توليد اين پروتئین نوترکیب از سیستم های ساده ميكروبي و نيز گیاهان استفاده گردد.

در اينجا به منظور مطالعه بیان TNFα انسانی، cDNA کد کنندۀ hTNFα حاصل از RT-PCR ي mRNA سلول های ماکروفاژ انسان، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی از قبل طراحی شده تکثیر گردید. محصول PCR خالص سازی شده، در سايت برشي EcoRV که در داخل ناحیه کد کننده مقاومت به تتراسایکلین در pBR322 بود، الحاق شد. سرانجام به منظور بيان، ژن هدف در پلاسمیدتحت کنترل سیگنال های رونویسی و ترجمه قوی پروموتور باکتریوفاژT7كلون گرديد به اين ترتيب كه وكتور نوتركيب و نيز هر دو با آنزيم هاي NdeI-HindIII بريده شده و قطعهDNA bp 478 حاصل از برش pBRtnf در pET21a(+) خطي شده، اتصال و سپس در E. coli DH5α ترانسفورم شد. پس از بررسي صحت کلونینگ (توسط تکنیک PCR و آنزیم های برشی) و توالی یابی قطعه کلون شده، بیان سیتوپلاسمی hTNFα نوترکیب در سویه BL21(DE3) E.coliاز طریق تکنیک های SDS-PAGEو نيز وسترن بلاتینگ مورد تاييد قرار گرفت.

 

مقدمه

فاکتور نکروز کننده تومور آلفا (TNF-α) سایتوکایني پیش التهابی است كه در راه اندازی و تنظیم سيستم ايمني ذاتی و پاسخ های التهابی حاد در برابر باکتری های گرم منفی و سایر میکروب هاي بیماری زا از طريق فراخواني نوتروفیلها و منوسیت ها به محل عفونت دخالت دارد. TNF-α براي اولين بار از سرم موش ها و خرگوشهایی که با سویه BCG مایکوباکتریوم بوویس يا آندوتوكسين باكتري ها تيمار شده بودند جداسازي شد كه در مرگ سلول هاي توموري نقش ايفاء مي كرد. اگر چه وجه تسمیه این فاکتور به علت ویژگی های ضد توموری آن است اما اين پلی پپتید 17 کیلودالتونی داراي عملكردهاي متعددي نظير دخالت در آپوپتوزیس، زنده ماندن سلول، التهاب، تنظيم خواب و رشد رويان مي باشد.اين فاكتور غالباً توسط ماکروفاژهای فعال، لنفوسیت هایT ي CD4+، لنفوسیت هایT ي CD8+، سلول های NK و ماست سل ها بيان مي شوند. بیان آن در سلول های دیگر مانند فیبروبلاست ها، سلول های عضلات صاف و سلول های توموری پایین است.

TNF-α نوترکیب امروزه به طور گسترده در تحقیقات علوم پایه و بالینی و نيز به منظور درمان تومور مورد استفاده قرار می گیرد. لذا با توجه به اهمیت آن تولید و تخلیص TNF-α به شکل نوترکیب در موجودات پروكاريوتي در كشور می تواند باعث فراهم شدن زمينه جهت انجام تحقیقات بعدی نظير تحقیقات ملکولی، پزشکی و بالینی بر روی این سایتوکاین مهم باشد. به علاوه امکان تولید آنتی بادی های منوکلونال و پلی کلونال برعلیه TNF-α که امروزه کاربردهای بسیار وسیعی در تشخیص و درمان بیماریهای مختلف دارند نيز فراهم می شود. از سوی دیگر با توجه به نقش ویژه TNF-α در مقابله با تومورهای سرطانی، تولید TNF نوترکیب می تواند دریچه ای نوین در برابر تحقیقات سرطان شناسی و نیز درمان تومورهای سرطانی فراروی محققین کشور بگشاید.

1-1- بیوتکنولوژی پروتئین­های دارویی

بیوتکنولوژی (زیستفناوری)، مجموعه فنونی است که از سیستم زنده برای تولید یا تغییر فرآورده­های زیستی در جهت بهداشت و اقتصاد عمومی استفاده می­کند(Wallman, 1997). گر­چه استفاده از میکروارگانیسم­ها برای تولید فرآورده­های زیستی دارای سابقه طولانی است ولی در زمینه بیوتکنولوژی مدرن امروزینظیر تکنیک­های مهندسی ژنتیک و تکنولوژی DNAنو­ترکیب، کاربرد فراوان دارند. اصطلاح بیوتکنولوژی نخستین بار در سال 1917توسط کارل ارکی[1] به کار برده شد. در سال 1973 هربرت بویر[2] و استنلی کوهن[3] تکنولوژی DNA نو­ترکیب را ارایه دادند و در سال 1976 اولين شركت مستقل بيوتكنولوژي،­Genentech، به منظور تجاري كردن اين تكنولوژي جديد تاسيس شد. در سال 1982 انسولین انسانی نو­ترکیب با استفاده از تكنولوژي DNA نوتركيب براي نخستين بار در E. coli به مرحله تولید رسید(Mckown and Coffman, 2002).پیش از بکار بردن روشهای بیوتکنولوژی، تنها منبع تولید پروتئین­های دارویی منابع طبیعی آنها نظیر خون و بافت­های انسانی و حیوانی بود که اغلب به میزان بسیار اندک و با صرف هزینه بسیار بالا تهیه می­شد. همچنین به دلیل مشکل بودن روشهای خالص سازی و از طرفی آلرژی­زا بودن پروتئین­های حیوانی برای انسان و امکان بروز اثرات جانبی، استفاده از این ترکیبات را محدود می­نمود(Brown, 2001). امروزه تکنولوژی DNA نو­ترکیب امکان آن را فراهم کرده است که بتوان cDNA کد کننده هر پروتئین را جدا کرده و به یک سیستم بیان کننده مناسب وارد کرد. در این حالت پروتئین مورد نظر در موجود بیگانه که اغلب یک میکروارگانیسم است،

 

 

بیان می­شود(Glick and Eds, 1998). به این ترتیب می­توان پروتئین­های دارویی را در مقیاس انبوه و بسیار ارزان­تر از روش­های قبلی تولید نمود(Walsh and Headon, 1994).

در حال حاضر بیش از 100 پروتئین دارویی نو­ترکیب برای درمان بیماری­های انسانی در بازار وجود دارد و در حدود 400 داروی جدید در درمان بیماری­های مختلف به ویژه سرطان، ایدز و ناراحتی­های دستگاه عصبی در مراحل کار آزمایی بالینی قرار دارند(Mckown and Coffman, 2002).

تکنولوژی دارویی مدرن از کلون کردن ژن و تکنولوژی DNA نوترکيب بهره می­گيرد. هدف نهايی بيوتکنولوژی دارويی ژن درمانی و ورود مواد ژنتيکی به سلول­ها برای جلوگيری يا کنترل و يا معالجه بيماری می­باشد(Ossege, Sindern et al., 1998). جدول 1-1 برخی از پروتئین­های دارویی تولید شده به صورت نو­ترکیب (T. A. Brown) را نشان می­دهد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 1-1: برخی از پروتئین­های نو­ترکیب موجود در بازار دارویی (T. A. Brown)

Used in the treatment of	Protein
Diabetes	Insulin
Growth disorders	Somatostatin
Growth disorders	Somatrotropin
Haemophilia	Factor VIII
Christmas disease	Factor IX
Leukamia and other cancers	Interferon-α
Cancers, AIDS	Interferon-β
Cancers, rheumatoid arthritis	Interferon-γ
Cancers, immune disorders	Interleukins
Cancers	Granulocyte colony stimulating factor
Cancers	Tumour necrosis factor
Ulcers	Epidermal growth factor
Ulcers	Fibroblast growth factor
Anaemia	Erythropoietin
Heart attack	Tissue plasminogen activator
Free radical damage in kidney transplants	Suproxide dismutase
Respiratory distress	Lung surfactant protein
Emphysema	1-antitrypsinα
Used as a plasma supplement	Serum albumin
Used to aid childbirth	Relaxin

 

1-2- کلون کردن ژن

كلون كردن عبارت است از به وجود آوردن نسخهکاملاً مشابه يك قسمتكوچكي از DNA، سلول و يا موجود كامل. كلون كردن ژن تحت عناوين كلون كردن مولكولي و تكنولوژيDNA نو­تركيب نيز شناخته مي­شود(Brown 1996). در این تکنیک يك توالي ژني را جدا كرده و با آنزیم اختصاصی برش می­دهند. سپس با استفاده از آنزیمDNA لیگاز[4]DNA مورد نظر در يك وكتور مناسب قرار داده می­شود. هیبرید حاصله را ConstructDNA گویند. که با انتقال به باکتری و یا سلول میزبان امکان تکثیر آن فراهم می­شود(Maeyer and De Maeyer-Guignard, 1998). در سال 1973، نخستین DNA نو­ترکیب با استفاده از آنزیم­های برشی و آنزیم لیگاز در دانشگاه Stanford آمریکا ساخته شد.

کشف تکنولوژی DNA نو­ترکیب سر­آغاز پیشرفت­های جدید در علوم و بیوتکنولوژی شد. یکی از خصوصیات مهم ژن کلون شده در تکنولوژی DNA نو­ترکیب، این است که اغلب می­تواند درون موجودی دیگر که کاملاً متفاوت با موجود اولیه است، فعالیت خود را انجام دهد(Michael and et., 1982). اهميت اصلي كلون كردن ژن به دست آوردن مقادير كافي از ژن­هاي مورد نظر براي تجزيه و تحليل بعدي است و امكان آزمايشات ژنتيكي براي فهم مكانيسم­هاي دخيل در بيماري­هاي ژنتيكي و در نتيجه پيدا كردن راهكارهاي مناسب براي تشخيص و درمان آنها را فراهم مي­آورد. كلون كردن ژن همچنين در داروسازي امروزه براي ساخت داروها با ساختار پروتئين نقش اساسي دارد. در حال حاضر یکی از مهمترین راهکارهای استفادة درمانی از این فناوری در توسعة روش­های درمانی نوین از جمله ژن درمانی است.

1-2-1- ابزار و عوامل کلون کردن ژن

همانطور که قبلاً ذکر شد اساس کلون کردن، برش دادن مولکول­های متفاوت DNA و اتصال دوبارة آنها است. برای این کار ابزارهای مولکولی لازم است که مهمترین آنها آنزیم­های محدود کننده[5] و آنزیم لیگاز هستند.

1-1-2-1- آنزیم­های برشی

در كلون كردن ژن، براي ايجاد يك مولكول DNAي نو­تركيب، ناقل بايستي به صورت کاملاً دقیق در يك نقطه مشخص(با امكان اتصال و برش دوباره) برش داده شود تا قطعه DNA كه قرار است، کلون

 

شود، در آن نقطه وارد گردد. اندونوكلئاز­هاي برشي، آنزيم­هايي هستند كه قطعه DNA را در مكان­هاي اختصاصي برش مي­دهند. اولين آنزيم برشي در سال 1970 از باكتري Haemophilus influenzaeجداسازي شد. انواع مختلف باکتری­ها انواع متفاوتی از این آنزیم­ها را تولید می­کنند. به همین دلیل اسامی آنها معمولاً از نام باکتری­های مولد آنها مشتق شده است(McDonald, 1996).

2-1-2-1- آنزيم DNA لیگاز

يكي از آنزيم­هاي مهم در سلول براي اتصال قطعات، DNA ليگاز ناميده مي­شود که موجب بازسازی پیوندهای فسفودی­استری از هم گسیخته می­گردد. هر گاه DNAي ناقل و DNAي خارجي هر دو با يك آنزيم برشي بريده شوند، نواحي انتهايي متناظر در ناقل و DNAي خارجي با يكديگر سازگار بوده و مكمل يكديگرند. و توالي­هاي تك رشته­اي انتهاهاي مكمل با هم جفت مي­شوند. ليگاز­ها روي قطعات برخوردار از گروه فسفات در انتهاي 5 عمل كرده و با ايجاد پيوند فسفودی­استری سبب بر­قراري اتصال بين دو توالي DNA مي­شوند، اين فرايند كه به اتصال[6] معروف است، آخرين مرحله ساخته شدن يك مولكول DNAي نو­تركيب است.

در کلون کردن ژن­ها نوع آنزيمي كه معمولاً مورد استفاده قرار مي­گيرد، DNA ليگاز T4 است كه از باكتري­هاي E. coliآلوده شده با باكتريوفاژ T4 به دست مي­آيد. زيرا اين آنزيم هم قادر به اتصال رشته هاي DNAي دو رشته­اي با انتهاي صاف و هم با انتهاي چسبان مي­باشد در حالي كه DNA ليگاز باكتري E. coli در اتصال قطعات با انتهاي صاف ناتوان است. دماي بهينه فعاليت هر دو آنزيم در سيستم بيولوژيكي 37 درجه است. ولي از آنجا كه براي اتصال قطعات جدا از هم و مكمل تشكيل اوليه

 

 

پيوندهاي هيدروژني بين نوكلئوتيدهاي مكمل ضروري است و در واكنش درون شيشه­اي[7] پيوندهاي هيدروژني، پايداري چنداني در مقابل دماي بالا ندارند به همين دليل اين نوع واكنش­ها در دماهاي پايين 16-4 درجه سانتيگراد و به مدت طولاني انجام شود(McDonald, 1996).

2-2-1- وکتورهای کلونینگ

براي اين كه بتوان قطعه­اي از DNAي دلخواه (موسوم به Insert DNA) را با استفاده از شرايط طبيعي (in vitro) تكثير كرده و براي مطالعات بيشتر استفاده نمود، لازم است DNA را توسط مولكول­هاي وکتور به سلول­هاي مورد نظر انتقال داد. در غير اين صورت، عمل انتقال، تكثير و يا استخراج DNAي مورد نظر امكان­پذير نمي­شود. نظر به اين كه قطعات تكثير شده همه با هم يكسان هستند، اين نوع متدولوژي به همسانه­سازي DNA موسوم است. مولكول­هاي وکتور DNA(DNAVector) كه خود DNA مي­باشند، بنا به داشتن توالي به خصوصي قادر هستند در سلول­هاي ميزبان خود به تعداد زيادي تكثير شوند. در اين صورت قطعه DNAي دلخواه نيز به همراه وکتور خود تكثير مي­شود.

وكتورهاي DNA تنوع بسيار زيادي دارند. مهمترين عامل طبقه­بندي آنها ميزان ظرفيت حمل DNA به سلول ميزبان است. قطعات DNA را مي­توان از چند نوكلئوتيد گرفته تا بيش از صد هزار نوكلئوتيد توسط وكتورهاي مناسب همسانه­سازي نمود. به همين دليل در طراحي اوليه بايد ابتدا اندازه DNAي مورد نظر را مشخص و وكتور مناسبي انتخاب نمود. پلاسمیدها، فاژλ، کاسمید و کروموزوم­های مصنوعی مخمر(Yeast artification chromosom) از وکتورهایی هستند که بیش از سایر وکتورها مورد استفاده قرار می­گیرد(Larry and Champness, 2007).

 

 

مشخصات كلي وكتورهاي كلونينگ

وكتورهاي مختلف DNA با تنوع بسيار زياد، شامل اندازه­ها و ظرفيت­هاي حمل مختلف موجود مي باشند، ولي داراي نقاط مشترك اساسي ذيل هستند:

· مبدا همانند­سازي[8]

همهوكتورها داراي توالي­هاي ويژه­اي هستند كه توسط آنزيم DNA پلي­مراز سلول ميزبان شناسايي شده و به تعداد بسيار زيادتر از ژنوم خود ميزبان تكثير مي­شوند اين توالي به مبدا همانند­سازي موسوم است وبا Ori نشان داده مي­شود. برخي وکتورها حاوي دو نوع Ori براي تكثير در دو نوع سلول ميزبان مي باشند. همانند­سازي وكتور توسط DNA پلي­مراز سلول ميزبان، در اين ناحيه شروع و در دو جهت (Bi-directional) مخالف هم ادامه مي­يابد.

• نشانگرهای انتخابی[9]

همه وكتورها حامل ژن­هايي هستند كه به واسطه ايفايش آنها مي­توان وجود وكتور را به سهولت در داخل سلول ميزبان رديابي نمود. متداول­ترين نشانگرها، ژن­هايي هستند كه فرآورده آنها باعث بروز مقاومت در برابر آنتي­بيوتيك­هاي به خصوصي مي­شود. در صورتي كه وكتور به داخل سلول ميزبان حساس به يك آنتي­بيوتيك انتقال يابد، مي­تواند در حضور همان آنتي­بيوتيك زنده مانده و رشد كند. انواع نشانگرهاي رايجي كه مقاومت به آنتي­بيوتيك به خصوصي را در سلول ميزبان القاء مي­كنند، آمپي سيلين[10]، تتراسايكلين[11]، جنتامايسين[12]، كانامايسين[13] و استرپتومايسين[14] مي­باشند.

 

 

• نشانگرهای ژنتیکی[15]

دسته ديگري از نشانگرها، ژن­هايي هستند كه عامل كنترل يك سري واكنش­هاي بيوشيميايي هستند. و در حضور مواد زمينه خاصي واكنش­هاي به خصوصي را بر­مي­انگيزند. مثلاً ژن LacZ كه استفاده از آن بسيار متداول مي­باشد در صورت انتقال به سويه­اي از باكتري E. coli كه اين ژن را ندارد باعث توليد آنزيم بتا-گالاكتوزيداز مي­شود كه مي­تواند روي ماده­اي بنام X-Gal اثر کرده و رنگ آبي در محيط اطراف سلول توليد کند. براي تشخيص اينكه سلول ميزبان حاوي وکتور DNA است، استفاده از يك نوع نشانگر كافي است ولي براي اينكه بتوان ماهيت وکتور را در رابطه با حامل بودن DNA وارد شده بررسي نمود، استفاده از نشانگرهاي ثانوي ضروري می­باشد.

• جایگاه کلونینگ متعدد[16] (MCS)

براي اينكه بتوان DNA وارد شده را با استفاده از مكانيسم نوتركيبي[17] وارد قسمت خاصي از DNAي وکتور کرد، در ساده­ترين روش كار لازم است با استفاده از آنزيم­هاي برش دهنده هر دو DNA را برش داده و قطعات برشي و سپس دو نوع DNA را به هم اتصال داد در وکتورهاي جديد جايگاه کلونینگ يا MCS شامل توالي­هايي است كه حاوي توالي­هاي شناسايي و جايگاه برش براي آنزيم­هاي برش دهنده متعدد مي­باشد. در کلونینگ بايد از آنزيم­هايي استفاده كرد كه فقط مي­توانند يكبار DNA وکتور را مورد برش قرار دهند به همين دليل اين جايگاه­ها را جايگاه برشي منحصربه فرد مي­نامند. بنابر اين MCS هر وکتور جايگاه برشي آنزيم­هايي را ارائه مي­كند كه در تمامي طول وکتور منحصر به فرد[18]هستند. اگر­چه وجود MCS در يك وکتور الزامي است اما اين جايگاه بايد در مكان ويژه­اي در روي وکتور قرار گرفته باشد به طور رايج اين محل در ناحيه ´5 ژن LacZ قرار دارد كه وجود آن در اين محل در توليد فرآورده اين نشانگر اختلالي ايجاد نمي­كند در صورت وارد كردن DNA در جايگاه MCS توالي اين ژن مختل شده و عدم توليد كلوني­هاي آبي رنگ در حضور X-Gal وجود DNAي وارد شده را نشان مي­دهد.

• جایگاه­های پروموتر[19]

بسته به هدف کلونینگ، وكتورهاي متفاوتي طراحي شده­اند و به منظور انجام عمليات مختلف، توالی­هاي ويژه­اي در يك يا دو رديف MCS قرار داده شده­اند. اين توالی­هاي اليگو­نوكلئوتيدي محل شناسايي و كنترل آنزيم­هاي مختلف از منابع متفاوت هستند كه در سويه­هاي مختلفE. coli موجود مي­باشند. به اين ترتيب بايستي براي اهداف و عمليات بخصوص، وكتور و سويه باكتري مناسب و سازگاري را انتخاب نمود. ممكن است هدف از کلونینگ توليد و تكثير DNA هدف، توليدmRNA از DNAي هدف يا اين كه توليد فرآورده پروتئيني کد شونده از DNAي هدف باشد. وجود پروموترهاي ويژه و آنزيم­هاي مربوطه انجام اين نوع عمليات را بر­عهده دارند.

Expression Vector

 

کلیات تحقیق.. 2

1-1 گیاه­شناسی پپرومیا. 2

1-2 نگهداری گیاه پپرومیا. 2

1-3 نقش کشت بافت در تکثیر گیاهان. 3

1-4 ترکیبات محیط­های کشت. 5

1– 4 – 1 مواد غیر آلی. 6

1– 4– 2 منبع کربن. 6

1 – 4 – 3 ویتامین­ها. 6

1 – 4 – 4 آمینواسیدها و مکمل­های آلی. 7

1 – 4- 5 تنظیم کننده­های رشد گیاهی. 7

1 – 4 - 6 عامل ژله­ای­کننده. 7

1– 4 – 6 – 1 آگار. 7

1-5 ظروف کشت. 8

1 – 6 انتخاب و تهیه ریزنمونه. 8

1 – 7 ریزازدیادی. 8

1-8 کودهای زیستی. 9

1-9 باکتری­های محرک رشد گیاه (PGPRها). 9

1-10 مکانیسم عمل PGPRها. 11

1-10-1 نقش مستقيم PGPRها. 12

1-10-2 نقش غيرمستقيم PGPRها. 13

1-11 اهداف تحقیق. 13

فصل دوم: مروری بر تحقيقات انجام شده. 15

2– 1 سوابق استفاده از PGPRدر کشت بافت سایر گیاهان. 15

2– 2 سوابق استفاده از PGPRدر کشاورزی. 15

فصل سوم: مواد و روشها22

3 – 1 محل انجام آزمایش. 22

3 – 2 تهیه گیاه مادری. 22

3-3 تهیه و واکشت سویه­های باکتریایی. 22

3-4 ترکیبات و ساخت محیط کشت. 23

3-5 ضدعفونی ریزنمونه­های گیاهی پپرومیا. 24

3-6 شرایط کشت ریزنمونه­ها. 26

3-7 کشت اولیه. 26

3-8 آزمایش بررسی اثر استفاده از تیمارهای مختلف گندزدایی در جلوگیری از آلودگی در کشت بافت گیاه پپرومیا. 26

3-9 بررسی تاثیر افزایش غلظت فسفر بر اندام­زایی پپرومیا. 27

3-10 اثر سطوح مختلف ساکارز بر اندام­زایی پپرومیا. 28

3-11 تاثیر سطوح هورمونی و تلقیح با باکتری بر رشد ریزنمونه جوانه جانبی درون شیشه. 28

3- 12 تاثیر تلقیح با باکتری بر سازگاری گیاهان تکامل یافته در گلدان. 29

3-13 صفات اندازه­گيري شده. 30

3-13-1 میانگین تعداد برگ در هر بوته. 30

3-13- 2 ارتفاع ساقه. 30

3-13-3 تعداد ریشه در هر بوته. 30

3-13-4 طول کل ریشه. 30

3-13-5 تعداد جوانه جانبي. 30

3-13-6 توسعه برگي. 30

3-13-7 وزن تر بوته. 31

3-13-8 وزن خشک بوته. 31

3-14 تجزیه آماری. 31

فصل چهارم: نتايج و بحث.. 32

4-1 مقدمه. 32

4-2 بررسی اثر استفاده از تیمارهای مختلف گندزدایی در جلوگیری از آلودگی در کشت بافت گیاه پپرومیا. 32

4– 3 بررسی تاثیر افزایش غلظت فسفر بر اندام­زایی پپرومیا. 33

4-4 اثر سطوح مختلف ساکارز بر اندام­زایی پپرومیا. 34

4-5 تاثیر سطوح هورمونی و تلقیح با باکتری بر رشد ریزنمونه جوانه جانبی درون شیشه (2 هفته بعد از كشت). 34

4-5-1 تعداد برگ. 35

4-5-2 طول ساقه باززا شده. 36

4-5-3 تعداد ريشه باززا شده. 37

4-5-4 کل طول ریشه باززا شده. 37

4-5-5 ميانگين طول ریشه. 38

4-5-6 تعداد جوانه رشد كرده. 39

4-5-7 توسعه برگي. 39

4-6 تاثیر سطوح هورمونی و تلقیح با باکتری بر رشد ریزنمونه جوانه جانبی درون شیشه (چهار هفته بعد از كشت). 41

4-6-1 تعداد برگ. 41

4-6-2 طول ساقه. 42

4-6-3 تعداد ريشه. 43

4-6-4 کل طول ریشه باززا شده. 44

4-6-5 ميانگين طول ریشه. 46

4-6-6 تعداد جوانه رشد كرده. 47

4-6-7 توسعه برگي. 47

4-7 تاثیر سطوح هورمونی و تلقیح با باکتری بر رشد گیاهچه­های کشت بافتی پپرومیا در مرحله سازگاری. 47

4-7-1 تعداد برگ. 48

4-7-2 طول ساقه. 49

4-7-3 تعداد ريشه. 49

4-7-4 کل طول ریشه. 49

4-7-5 ميانگين طول ریشه. 50

4-7-6 توسعه برگي. 50

4-7-7 وزن تر بوته. 51

4-7-8 وزن خشک بوته. 52

4-8 اندام­زایی مستقیم در گیاه پپرومیا. 53

فصل پنجم: نتيجه گيری.. 54

5-1 بحث. 54

5-2 نتایج. 56

5-3 پیشنهادات. 57

منابع.. 58

 

فهرست جداول:

 

عنوان صفحه

 

جدول 3-1 مقادیر قند به کار رفته در محیط کشت .............................................................................................. 30

جدول 4-1 نتایج تجزیه واریانس اثر تیمارهای مختلف ضدعفونی در جلوگیری از آلودگی ریزنمونه در کشت بافت پپرومیا..................................................................................................................................................................... 35

جدول 4-2 خلاصه تجزیه واریانس اثر سطوح مختلف هورمون و باکتری بر صفات مربوط به رشد درون شیشه ای ریزنمونه جوانه جانبی پپرومیا ................................................................................................................................38

جدول 4-3 خلاصه تجزیه واریانس اثر سطوح مختلف هورمون و باکتری بر صفات مربوط به رشد درون شیشه ای ریزنمونه جوانه جانبی گیاه پپرومیا ­(تاریخ دوم)......................................................................................................44

جدول 4-4 خلاصه تجزیه واریانس سطوح مختلف هورمون و باکتری بر صفات مربوط به رشد گیاهچه­های کشت بافتی پپرومیا در مرحله سازگاری......................................................................................................................................51

فهرست نمودار­ها:

عنوان نمودار صفحه نمودار4-1 درصد بروز آلودگی ریزنمونه تحت تیمارهای مختلف ضدعفونی در کشت بافت گیاه پپرومیا .... 36 نمودار 4-2 اثر تیمار باکتری بر تعداد برگ گیاه پپروميا درون شیشه............................................................... 39 نمودار 4-3 اثر تیمار باکتری بر طول ساقه باززا شده گیاه پپروميا ................................................................... 40 نمودار 4-4 اثرمتقابل سطوح هورمون و باکتری بر كل طول ریشه در گیاه پپروميا درون ............................... 41 نمودار 4-5 اثرمتقابل سطوح هورمون و باکتری بر ميانگين طول ریشه در گیاه پپروميا درون شیشه............... 42 نمودار 4-6 اثرمتقابل سطوح هورمون و باکتری بر تعداد برگ گیاه پپروميا درون شیشه (تاريخ دوم).............. 45 نمودار 4-7 اثر سطوح هورمون بر طول ساقه باززا شده گیاه پپروميا (تاريخ دوم) .......................................... 46 نمودار 4- 8 اثر سطوح هورمون بر تعداد ريشه باززا شده گیاه پپروميا (تاريخ دوم)....................................... 47 نمودار 4-9 اثر تيمار باكتري بر تعداد ريشه باززا شده گیاه پپروميا (تاريخ .......................................................47 نمودار 4- 10 اثر سطوح هورمون بر كل طول ريشه باززا شده گیاه پپروميا (تاريخ ....................................... 48 نمودار 4- 11 اثر تيمار باكتري بر كل طول ريشه باززا شده گیاه پپروميا (تاريخ دوم)...................................... 49 نمودار 4- 12 اثر سطوح هورمون بر ميانگين طول ريشه باززا شده گیاه پپروميا (تاريخ دوم).......................... 50 نمودار 4- 13 اثرمتقابل سطوح هورمون و باکتری بر تعداد برگ گیاه پپروميا در مرحله سازگاري .................. 52 نمودار 4 -14 اثر سطوح هورمون بر طول كل ريشه گیاه پپروميا در مرحله سازگاري...................................... 53 نمودار 4- 15 اثرمتقابل سطوح هورمون و باکتری بر توسعه برگ گیاه پپروميا در مرحله سازگاري ................ 54 نمودار 4- 16 اثر تیمار باکتری بر وزن تر گیاه پپروميا در مرحله سازگاري...................................................... 55 نمودار 4- 17 اثرمتقابل سطوح هورمون و باکتری بر وزن خشك گياه پپروميا در مرحله سازگاري ................ 56

 

فهرست شکل­ها­:

 

عنوان شکل صفحه   شکل 1-1 گیاه پپرومیا (برگ قاشقی) .................................................................................................. 5 شکل 3-1 قرار دادن باکتری­ها بر روی شیکر جهت تهیه مایع تلقیح ................................................. 25 شکل 3-2 ساخت محیط کشت و تنظیم pH محیط کشت ............................................................... 26 شکل 3-3 انجام آبشویی قبل از استفاده از مواد شیمیایی برای ضدعفونی .......................................... 27 شکل 3-4 شیشه­های حاوی ریز نمونه پپرومیا .................................................................................. 27 شکل 3-5 نگهداری ریز نمونه­ها در شرایط مطلوب ایجاد شده در اتاق رشد ................................... 28 شکل 3-6 گیاهچه­های پپرومیای کشت بافتی منتقل شده به گلدان .................................................... 32 شکل 4-1ریزنمونه كشت شده در آزمایش فسفات ............................................................................ 37 شکل 4-2 ريشه­هاي ايجاد شده بر روي ريزنمونه برگی گیاه پپرومیا ................................................. 38 شکل 4-3 ریزنمونه ریشه­دار شده پپرومیا در محیط تلقیح شده با باکتری .......................................... 43 شکل 4-4 ريزنمونه پپرومیا تلقیح شده با تیمار باکتریایی محرک رشد ............................................... 43 شکل 4-6 اندام­زایی مستقیم قطعات برگی گیاه پپرومیا (ریشه­زایی) ................................................... 60

 

جدول علائم و اختصارها:

 

معادل فارسی	معادل انگلیسی	علامت
ام اس	Murashic and Skoge	MS
آی ای ای	Indol Acetic Acid	IAA
ای بی ای	Abscisic Acid	ABA
ان ای ای	Naftalin Acetic Acid	NAA
آی بی ای	Indol Butyric Acid	IBA
پی جی پی آر	Plant Growth Promoting Rhizobacteria	PGP

 

چکیده:

باکتری­های محرک رشد گیاهی به عنوان یکی از راه­های افزایش رشد گیاه شناخته می­شوند. امکان استفاده از این موجودات در تحقیقات آزمایشگاهی گیاهی از جمله کشت بافت گیاهی هنوز در حال بررسی است. با توجه به اینکه این میکروارگانیزم­ها انواع مواد (از جمله اكسين، سيتوكينين، جيبرلين و سیدروفورها) را به محیط اضافه می­کنند، احتمال اینکه بر روی مراحل مختلف کشت بافت از ایجاد کالوس تا مرحله انتقال به خاک اثرات مثبتی داشته باشند وجود دارد. هدف از این تحقیق بررسی اثرات دو باکتری محرک رشد گیاهی بر روی تکثیر گیاه پپرومیا از طریق کشت بافت بود. آزمایش به صورت طرح فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملا تصادفی با سه تکرار اجرا شد. فاکتور باکتری محرک رشد شامل سطوح: 0: شاهد (بدون باکتری)، 2: Azospirillum lipoferrum، 3:Pseudomonas fluorescentو فاکتور هورمون شامل: 0: بدون هورمون، 1: سطح هورمون برابر با 5/1 میلی­گرم در لیتر IAA و 1 میلی­گرم در لیتر 2IP و 2: مقدار هورمون دو برابر غلظت قبلی بودند. قبل از کشت مقدار 08/0 میلی لیتر از کشت مایع باكتري­ها، بر روی محیط کشت تلقیح شد و سپس جوانه­های پپرومیا در محیط­های مذکور کشت شدند. بعد از گذشت 4 هفته از کشت، جوانه­های کشت شده گیاه پپرومیا به اندازه کافی رشد کرده و قابل انتقال به خاک شدند. قبل از انتقال گیاهچه­های جوان به گلدان و بعد از طی کردن مراحل سازگاری اندازه­گیری صفات مورد نظر انجام شد. نتایج نشان داد در آزمایش درون شیشه­ای اثر متقابل هورمون و باکتری بر کل طول ریشه و میانگین طول ریشه معنی­دار بود. تیمارAzospirillum بدون هورمون دارای بیشترین طول ریشه بود و اختلاف معنی دار با دیگر تیمارها داشت. اثر اصلی باکتری بر طول ساقه و تعداد برگ معنی­دار بود. مشاهده شد تلقیح ریزنمونه­ها با هر دو باکتری نسبت به شاهد باعث افزایش معنی­دار طول متوسط شاخه­های باززا شده گردید. افزایش طول ساقه در تیمارهای باکتری نسبت به شاهد در حدود 5/1 برابر بود. در مرحله سازگاری، اثرمتقابل هورمون و باکتری بر تعداد برگ، توسعه برگی و وزن خشک و اثر باکتری بر وزن تر و اثر هورمون بر کل طول ریشه و وزن خشک معنی­دار بود. در کل تلقیح با باکتری تاثيرات مثبتی بر تعداد برگ، توسعه برگی، طول شاخه و طول ریشه داشت. ولی تاثیر منفی تلقیح باکتری بر وزن تر و خشک مشاهده گردید. افزایش سطح هورمون تاثیر مثبت بر طول کل طول ریشه داشت.

 

کلمات کلیدی:کشت بافت،lipoferrum Azospirillum، Pseudomonas fluorescent، فيتوهورمون، پپرومیا.

 

فصل اول

کلیات تحقیق

 

1-1 گیاه­شناسی پپرومیا

گیاه پپرومیا (برگ قاشقی) از جنسPeperomia و خانواده Piperaceae می­باشد. این جنس دارای بیش از ۱۰۰۰ گونه مختلف از گیاهان همیشه­سبز بالارونده است که اغلب آنها برگ­های زیبایی دارند. گونه مذکور بومی نواحی استوایی آمریکا بوده و گیاهی است بسیار کم رشد که ارتفاع آن به حدود ۸ تا ۲۵ سانتی­متر مي­رسد. برگ­های آن بسیار زیاد و قلبی شکل می­باشند که از قسمت مرکزی گیاه خارج می­شوند. برگ­های پپرومیا صورتی کمرنگ می­باشد. گل­ها به رنگ سفید و به شکل گل آذین سنبله مانند و به طول ۱۲ تا ۱۵ سانتی­متر هستند و از اوایل بهار تا اواخر پاییز به چشم می­خورند. این گیاه به نور متوسط، حرارت زیاد، خاک همیشه مرطوب، رطوبت ۵۰ تا ۹۰ درصد و خاک قلیایی احتیاج دارد. کود مورد نیاز این گیاه را می‌توان به میزان ۲ گرم در لیتر، هر دو هفته یکبار از فروردین تا مهرماه، مورد استفاده قرار داد (کریمی، 1390).

 

1-2 نگهداری گیاه پپرومیا

پپرومیا گیاهی است گرمسیری با برگ­های چرمی شکل و قاشقی (شکل1-1)، این گیاه دارای نیاز آبی کم (بسته به شرایط محیط) می­باشد، و همچنین نیاز نوری کمی دارد و سایه آپارتمان را به خوبی تحمل می­کند، هم بصورت مجزا و هم در کاشت گروهی زیباست. این گیاه اگرچه رشد سریعی ندارد، ولی در هر شرایطی در آپارتمان پرورش می­یابد. معمولا آن­ها را در تراریوم و باغ شیشه­ای یا مجموعه­ی گل­های یک سبد پرورش می­دهند. با توجه به شکل ظاهری و نحوه­ی رشد آنها را به سه گروه تقسیم نموده­اند: گروه اول: بوته­ای که دارای دمبرگ­های قرمز هستند، بعضی نیز برگ­های گوشتی و قلبی شکل دارند، گروه دوم: دارای ساقه­های بلند و قرمز رنگ هستند و بعضی ساقه­های گوشتی دارند و لبه برگ­ها ارغوانی است و گاه سطح برگ با موهای بسیار ظریفی پوشیده شده است. گروه سوم: گروه بالارونده که به داربست یا قیم بسته می­شوند و بالا می­روند، با اینکه از گلدان آویزان می­شوند و دارای ساقه­های قرمز و بسیار ظریف نقره­ای و بعضی دارای برگ­های سبز آبدار هستند و بخصوص برای گلدان­های آویز بسیار مناسبند. گیاه پپرومیا یک ساقه گل­دهنده با شاتون­های سبز رنگ تولید می­کند که ارزش زینتی ندارد، زمانی که این گیاه به گل می­رود، کیفیت برگ­ها و زیبایی آن کمتر می­شود، با حذف ساقه­های گل­دهنده می­توان گیاه را مرتب به حالت رویشی و نونهالی مشاهده کرد. این گیاه به سرمای زیاد مقاومت ندارد و حداکثر می­تواند در زمستان 15 درجه سانتی­گراد را تحمل نماید و در فصل رشد دمای 24 تا 30 درجه برای آن بسیار مناسب است. این گیاه در زیر تابش اشعه فلورسنت پژمرده می­شود و نیاز چندانی به آب ندارد و همیشه مقدار زیادی آب در برگ­های آن وجود دارد و سطح خاک گلدان بین دو آبیاری باید کاملا خشک شود، ولی نباید آبیاری آنقدر به تعویق افتد که برگ­ها پژمرده شوند. در زمستان به آب ولرم نیاز دارد و مقدار آبیاری باید بسیار کمتر باشد، ریشه آن سطحی است و گسترش چندانی ندارد و در هوای آلوده، زرد و خشک می­شود، در صورت آب دادن زیاد اطراف یقه ساقه، موجب پوسیدگی اطراف آن می­شود. میزان رطوبت هوای لازم برای این گیاه حدود 50 درصد است، چنانچه رطوبت و حرارت و سرما از حد خود تجاوز کند، لکه­هایی بر سطح برگ ظاهر می­شوند، برگ را بی­حس می­کنند و می­افتد. هر دوماه یکبار سطح خاک گلدان را باید خراش داد تا هوا به داخل آن نفوذ کند و در فصل بهار گلدان را در فضای آزاد در محلی سایه قرار دهید تا حالت طبیعی خود را به دست آورد. هر اندازه قابلیت نفوذ خاک این گیاه بیشتر باشد ریشه و ساقه از پوسیدگی محفوظ خواهد بود. بهتر است برای تهیه خاک گلدان این گیاه یک قسمت پیت بعلاوه یک قسمت ماسه به همراه یک قسمت خاک باغچه استفاده شود و کف گلدان مقداری ماسه و سنگریزه بریزید، زمان مناسب برای تغییر گلدان این گیاه فصل بهار است. پپرومیای ابلق یا سفید با قلمه­های بذر و ساقه تکثیر می­شود و پپرومیای سبز با قلمه­های برگ و ساقه تکثیر می­شود. بهتر است در بهار و تابستان از قلمه­های یک ساله برای گیاه استفاده نمود و برای این کار قلمه را به میزان 4 تا 5 سانتی­متر در ماسه شسته فرو برده و در محلی که دمای آن 18 درجه باشد در تاریکی قرار می­دهند. در مورد انواع گوشتی آن برگ را روی سطح ماسه خوابانیده و روی آن ماسه شسته می­ريزند، پس از مدتی در انتهای رگبرگ­ها ریشه ظاهر می­شود (کریمی، 1390).

 

1-3 نقش کشت بافت در تکثیر گیاهان

تكنيك كشت بافت گياهي نقش كليدي در انقلاب سبز دوم دارد كه در اين انقلاب تغييرات ژني و بيوتكنولوژي جهت پيشرفت كيفيت و كميت محصولات زراعي بكار مي­روند. اين تكنولوژي براي محدوده وسيعي از گياهان زراعي و گونه­هاي درختي جهت حل مشكلات بكار گرفته شده است. اين روش بواسطه تلاش­هاي مداوم و پيگير تعداد زيادي از دانشمندان كه كارهاي پايه­اي انجام داده­­­اند، ممكن شده است. كشت بافت گياهي اصطلاحي است كه بطور كلي براي رشد درون شيشه­اي و عاري از بيماري گياه بر روي محيط مغذي بكار مي­رود. اين تكنولوژي بر سه اصل اساسي استوار است (باقری و همکاران، 1381):

• قسمتي كه بايد از گياه اصلي جدا شود.
• ريزنمونه بايد در شرايط شيميايي (محيط كشت) و فيزيكي (محيطي) تعريف شده نگهداري شود.
• شرايط استريل و عاري از آلودگي بايد حفظ شود

 

شکل 1-1 گیاه پپرومیا (برگ قاشقی)

 

دانش امروزي اجازه بكارگيري هر قسمت از گياه را براي شروع كشت مي­دهد. قسمتي از گياه كه براي اين منظور بكار مي­رود ريزنمونه ناميده مي­شود. انتخاب هر قسمت از گياه با توجه به هدف از كشت متفاوت است. مواد و نمونه­هايي كه از محيط خارج جمع­آوري و به آزمايشگاه آورده مي­شوند، در حين انتقال، بهتر است در شرايط مناسب نگهداري شوند تا فعاليت­هاي كاتابوليكي به حداقل برسد. مواد بطور كامل بايد با آب جاري و مايع شوينده شستشو داده شوند (مانند تويين-80[1])، بعد از شستشو و حذف ذرات چسبنده بسته به نوع ريزنمونه مراحل استريل انجام شده و سپس كشت انجام مي­شود. کشت بافت گیاهی یا کشت درون شیشه­ای عبارت است از رشد سلول، بافت و یا اندام گیاهی در یک محیط غذایی مصنوعی استریل که به صورت جامد یا مایع تهیه می­شود، این روش به عنوان یکی از شاخه­های زیست­فناوری، کاربرد گسترده­ای در کشاورزی دارد. در کشت بافت، قسمتی از گیاه به نام قلمه یا ریزنمونه که ممکن است بخشی از ساقه، برگ، جوانه و یا یک سلول باشد، در محیط کنترل شده کشت می­شود. در این نوع کشت، شرایط به گونه­ای است که عاری از هرگونه میکروارگانیسم بوده و رژیم متعادلی از مواد شیمیایی و آلی مورد نیاز رشد گیاه فراهم است. در واقع در کشت درون شیشه­ای محیط کشت بستری برای رشد گیاه است و ترکیبی از مواد شیمیایی و آلی در یک ژل مغذی یا محیط مایع برای رشد سلول­ها و بافت­ها می­باشد (شریفی و همکاران، 1389).

در سال 1838 شوان و شیلدن[2] نظریۀ توتی­پوتنسی[3] را ارائه نمودند. براساس این نظریه، هر سلول گیاهی، هنگامی که در محیط غذایی مصنوعی و شرایط مناسب کشت شود، می­تواند به گیاهی جدید و کامل تبدیل شود. بعد­ها دانشمند آلمانی، هابرلند[4] (1902) برای اولین بار به بررسی این نظریه پرداخت و ادعا کرد که اگر محیط و تغذیه سلول­های کشت شده مناسب باشند، سلول­های کشت شده می­توانند، گیاهان نرمالی را بوجود آورند. اما تلاش­های او در انجام کشت بافت ناموفق بود. او همچنین معتقد بود که قطعه قطعه کردن نامحدود بافت­های گیاهی بر روی قدرت تکثیر سلول­ها تأثیر نمی­گذارد. او استفاده از مایع موجود در کیسه جنینی و تولید جنین­های مصنوعی را از سلول­های رویشی پیشنهاد کرد (احمدیان، 1380). به دلیل تاخیر در کشف هورمون­های گیاهی، کشت بافت گیاهی پس از کشت بافت حیوانی و انسانی شروع شد. اولین کشت موفقیت­آمیز بافت­های گیاهی، توسط وایت[5] در سال 1934 انجام شد. او در سال 1939 اولین کشت موفقيت­آمیز کالوس هویج و توتون را گزارش کرد. اولین هورمون تنظیم­کننده رشد که کشف شد، اکسین بود که موفقیت بزرگی را برای کشت بافت در شرایط درون شیشه­ای به همراه داشت. بعد از کشف تنظیم­کننده رشد کینتین در سال 1955، انگیزه بیشتری برای کشت بافت حاصل شد. بزرگ­ترین مشوق برای استفاده از فنون کشت بافت گیاهی برای تکثیر بسیاری از گونه­ها، ممکن است کار اولیه مورل[6] روی تکثیر ارکیده و کار موراشیگ و اسکوگ[7] در 1964 در ایجاد محیط کشت جدیدی با غلظت بالای نمک­های معدنی بوده باشد (احمدیان، 1380).

 

1-4 ترکیبات محیط­های کشت

محیط کشت یکی از مهم­ترین اجزاء کشت یاخته و بافت گیاهی است. کاربرد موفق فنون کشت بافت گیاهی به میزان زیادی به محیط کشتی با ترکیب صحیح بستگی دارد. ترکیب محیط­های کشت به روش خاص کشت به کار رفته تغییر می­یابد. برای نمونه روش­هایی مانند باززایی گیاهان کامل از یاخته­ها یا بافت­ها نیازمند محیط­های کشتی با ترکیبات مختلف برای آغازش هریک از مراحل توالی تکوینی است. علاوه بر ترکیب آن، نقش مهم دیگر محیط کشت فراهم کردن محیط فیزیکی مناسب برای یاخته­ها و بافت­ها برای رشد می­باشد. برای نمونه محیط­های کشت جامد، نقشی شبیه خاک را از طریق فراهم کردن یک زمینه و حامل فیزیکی که ریزنمونه­های بافت بتوانند تماس با هوا را برای تبادل گاز حفظ نمایند یا جایی که گیاهچه­های باززایی شده بتوانند ریشه دهند، ایفا می­کنند. از سوی دیگر، کشت­های تعلیقی در حال رشد در کشت مایع در حال تکان خوردن، یاخته­ها را قادر می­سازد تا حداکثر تماس را با اجزای محیط کشت حفظ کنند و تبادل گاز­ها تسهیل شود. تمام یاخته­های گیاهی زنده برای حفظ و رشد و نمو نیازمند آب، عناصر غذایی (عناصر معدنی و ترکیبات آلی) و تنظیم­کننده­های رشد گیاهی (هورمون­ها) هستند. ترکیبات محیط­های کشت بافت گیاهی معمولا این نیازمندی­ها را منعکس می­سازند و چندین ترکیب اختصاصی (مانند محیط کشت موراشیک و اسکوگ یا محیط ام. اس) که به طور رایج برای کشت به کار می­روند دارای ترکیبات پایه مشابهی هستند. مواد مورد نیاز برای کشت یاخته گیاهی را می­توان به سه گروه تقسیم کرد که عبارتند از: عناصر غذایی معدنی، عناصر غذایی آلی و تنظیم­کننده­های رشد گیاهی (باقری و همکاران، 1383؛ شریفی و همکاران، 1389).

 

1– 4 – 1 مواد غیر آلی

عناصر غذایی غیر آلی، عناصر معدنی هستند و معمولا بر اساس غلظت­های ضروری به دو گروه تقسیم می­شوند: عناصر پر­مصرف که در مقادیر زیاد (غلظت­های میلی­مول) و عناصر کم­مصرف که تنها در غلظت­های بسیار پایین (میکرومول) ضروری می­باشند. عناصر پر­مصرف شامل: نیتروژن، گوگرد، فسفر، کلسیم، منیزیم، پتاسیم و عناصر کم­مصرف شامل: آهن، بر، کبالت، مس، ید، منگنز، مولیبدن و روی هستند. عناصر غذایی آلی در حالی که گیاهان سبز خود­پرورهستند، ولی بیشتر سیستم­های کشت حداقل در مراحل اولیه، خود­ناپرورمی­باشند و به یک منبع آلی کربن و انرژی نیازمند هستند. کشت­ها برای آغاز توسعه کلروپلاست­ها و فتوسنتز اغلب در روشنایی پرورش داده می­شوند. علاوه بر یک منبع آلی از کربن و انرژی، کشت­های گیاهی ممکن است به مولکول­های آلی پیچیده برای رشد سالم نیز نیازمند می­باشند (خسروشاهلی و همکاران، 1386).

 

1– 4– 2 منبع کربن

قند­ها برای تامین کربن و انرژی به محیط­های کشت گیاهی افزوده می­شوند. ساکارز متداول­ترین قند مورد استفاده در محیط­های کشت گیاهی است، ولی گلوکز، فروکتوز و سوربیتول در برخی از محیط­های کشت مورد استفاده قرار می­گیرند. علاوه بر نقش متابولیکی آن، ساکارز همچنین به عنوان یک اسمزنگهدار عمل می­کند و همراه با عناصر غذایی معدنی به تعادل پتانسیل اسمزی محیط کشت کمک می­کند (شریفی و همکاران، 1389).

 

1 – 4 – 3 ویتامین­ها

ویتامین­های افزوده شده، برای کشت­های یاخته و بافت گیاهی ضروری نیستند، هرچند ویتامین B1 (تیامین) برای کشت­های برخی از گونه­ها سودمند تشخیص داده شده است. با وجود این بیوتین، اسیدپانتوتنیک، اسیدنیکوتینیک (نیاسین)، پیریدوکسین (پیریدوکسول، ویتامین B6)، اسیدفولیک، اسیداسکوربیک (ویتامین C) و توکوفرول (ویتامین E) به برخی از محیط­های کشت افزوده می­شود. افزودن انفرادی عصاره مخمر[8] گاهی اوقات به عنوان منبع ویتامین­ها صورت می­گیرد. الکل قند میواینوزیتول به وفور در محیط­های کشت برای گیاهان تک لپه­ای، بازدانگان و برخی از گیاهان دولپه­ای به کار می­رود. این الکل قندی نقشی را در توسعه دیواده یاخته و غشاء ایفا می­کند (باقري و همكاران، 1383).

 

1 – 4 – 4 آمینو­اسید­ها و مکمل­های آلی

آمينواسيدها هنگام كاهش نيتروژن نقش خود را ايفا مي­كنند. در صورت ناكافي بودن نيتروژن، مكمل نيتروژن آلي كمپلكس مانند كازئين­هيدروليزات (1-1/0 گرم بر ليتر) ممكن است افزوده شود. گلايسين آمينواسيدي است كه عموما استفاده مي­شود. ساير مكمل­هاي آلي عبارتند از شير نارگيل، عصاره مخمر، پپتون و عصاره جو، هرچند محيط­هاي كشت مصنوعي ترجيح داده مي­شوند و مكمل­هاي آلي كه طبيعت شيميايي ناشناخته دارند فقط در مواقع ضروري بكار مي­روند (ابراهیم زاده و همکاران، 1384).

 

1 – 4- 5 تنظیم­کننده­های رشد گیاهی

پنج گروه اصلی از تنظیم­کننده­های رشد گیاهی یا هورمون­های­گیاهی وجود دارد که رشد و تمایزیابی در گیاه را هماهنگ می­کنند و عبارتند از: اکسین­ها، سایتوکینین­ها، جیبرلین­ها، اسید­­آبسزیک و اتیلن. اتیلن به طور عمده در ریزش، پیری گل و رسیدن میوه موثر است و به ندرت در کشت­های بافت گیاهی به کار می­رود. از چهار گروه دیگر هورمون­های گیاهی، اکسین­ها و سایتوکینین­ها به وفور در کشت­های بافت گیاهی به کار می­روند و جیبرلین­ها و اسید آبسزیک گه­گاه مورد استفاده قرار می­گیرند(خسروشاهلی و همکاران، 1386).

 

 

1 – 4 - 6 عامل ژله­ای­کننده

برای کشت بافت نیاز به یک عامل جامدکننده محیطی است تا نمونه به راحتی روی آن قرار گیرد و از غوطه­ور شدن آن جلوگیری به عمل آید (جورج و همکاران، 1987).

 

1– 4 – 6 – 1 آگار

آگار متداول­ترین ژل مورد استفاده در کشت بافت گیاهی است. آگار، پلی­ساکارید پیچیده­ای است که از جلبک قرمز استخراج شده است و از دو بخش آگارز (70 درصد) و آگاروپکتین (30 درصد) تشکیل شده است. آگارز بخش ژل­ساز بوده و شامل پلی­مری از واحد­های مونوساکارید متناوب د-گالاکتوز و 3،6- آنیدروگالاکتوز است. آگار در دمای حدود 100 درجه سانتی­گراد ذوب می­شود و در دمای حدود 35 درجه سانتی­گراد به حالت ژل در می­آید. آگار پایدار است، با اجزای محیط­های کشت واکنش نمی­دهد و به طور طبیعی توسط آنزیم­های گیاهی هضم نمی­شود (ابراهیم زاده و همکاران، 1384).

 

1-5 ظروف کشت

نوع ظروف استفاده شده در کشت بافت اثرات قابل توجهی بر سرعت رشد کشت­ها، کیفیت ساقه­ها و گیاه­چه­های تولید شده و درجه ی شیشه­ای شدن دارد. در این مورد بویژه حجم ظرف، رطوبت هوا در فضای بالای کشت درون ظرف و میزان تبادل گازی با هوای بیرون ظرف اهمیت خاصی دارد (مک کون و سلمر[9]، 1987).

 

1 – 6 انتخاب و تهیه ریزنمونه

زمانی که گیاه دهنده ریزنمونه در گلخانه یا اتاقک رشد پرورش می­یابند، گیاهان در تمام طول سال در مرحله مناسبی از رشد می­توانند در دسترس باشند. اما ریزنمونه­های حاصل از درختان فقط زمانی برای ریزازدیادی در شرایط مطلوب هستند که به موقع جمع­آوری شوند. نگه­داری مواد گیاهی جمع­آوری شده در زمان مناسب، طول دوره­ای را که از آن می­توان استفاده نمود افزایش می­دهد (احمدیان، 1380).

 

1 – 7 ریزازدیادی

سه نوع اصلی ریزازدیادی عبارت­اند از: 1- رشد طولی ساقه جانبی (پرآوری) 2- اندام­زایی 3- جنین­زایی

رشد طولی ساقه جانبی زمانی انجام می­شود که جوانه­های جانبی که بطور معمول غیرفعال­اند، از غالبیت انتهایی رهایی یابند. این کار بیشتر از طریق تغییر هورمون­ها (اساساً سایتوکینین­ها) در محیط کشت غذایی اعمال می­شود. برای رشد طولی ساقه جانبی، فراوان­ترین نوع ریزنمونه قطعات کوچک ساقه یا تک گره است. میزان تشکیل ساقه جانبی گاهی اوقات پس از چند واکشت افزایش می­یابد (خسروشاهلی و همکاران، 1386).

در اندام­زایی ساقه­های نابجایی القاء می­شوند که سپس ریشه­دار می­گردند. در این حالت به ندرت ریشه­ها قبل از ساقه ایجاد می­شوند. در جنین­زایی، جنین­های سوماتیکی از رشد یک سلول ایجاد شده و پس از بلوغ به یک گیاه کامل تبدیل می­شوند.

 

1-8 کودهای زیستی

مسئله استفاده بي­رویه و نادرست از سموم و کودهاي شیمیایی بسیار جدي و از چند جنبه قابل بررسی است. از مهم­ترین آن آسیب زیست محیطی و بهداشتی است. جنبه دیگر نیز بُعد اقتصادي آن است. بقایا و آثار ترکیبات کود شیمیایی در محیط آب و خاك موجب برهم خوردن تعادل اکوسیستم­ها می­شود. این معایب کودهاي شیمیایی و هزینه بالاي تولید آنها باعث شد که تولید کودهاي زیستی مورد توجه جدي قرار گیرد. در نظام­هاي کشاورزي پایدار کاربرد کودهاي زیستی از اهمیت ویژه­اي در افزایش باروري و حفظ حاصلخیزي پایدار خاك برخوردار است. امروزه استفاده از ظرفیت­هاي طبیعی ارگانیسم­هاي مفید خاکزي با هدف بهره­گیري از توانایی و پتانسیل آنها به منظور تولید حداکثر محصول مورد توجه قرار گرفته است (وسی، 2003).

دامنه میکروارگانیسم­هاي خاکزي مورد استفاده در تولید کودهاي زیستی در طول قرن بیستم توسعه بسیاري یافته است و امروزه طیف وسیعی از باکتری­هاي خاکزي (انواع ریزوبیوم، سودوموناس، ازتوباکتر، آزوسپریلوم، باسیلوس و غیره)، قارچ­ها (انواع قارچ­هاي میکوریزي و اندوفیتی) و جلبک­ها با مکانیسم­هاي مختلف براي تولید کودهاي زیستی استفاده می­شوند. با این حال هنوز هم باکتری­ها فراوان­ترین انواع در توليد کودهاي زیستی محسوب می­شوند. امروزه کودهاي زیستی در فرمولاسیون­هاي متفاوت براي محصولات مختلف کشاورزي از قبیل غلات، سبزي و صیفی، گیاهان صنعتی، باغات و گلخانه­ها استفاده می­شوند (اسدی رحمانی، 1389). اهمیت استفاده از PGPR­ها برای گیاهان مختلف به عنوان کود زیستی هر روزه در حال افزایش می­باشد و تحقیقات وسیعی در این مورد در حال اجراست. اما امکان استفاده از این موجودات در تحقیقات آزمایشگاهی گیاهی از جمله کشت بافت گیاهی هنوز در حال بررسی است. با توجه به اینکه این میکروارگانیزم­ها انواع مواد را به محیط اضافه می­کنند، احتمال اینکه بر روی مراحل مختلف کشت بافت از ایجاد کالوس تا مرحله انتقال به خاک اثرات مثبتی داشته باشند وجود دارد. در این مورد گزارش­های بسیار اندکی موجود است و تحقیق بر روی این موضوع ضروری به نظر می­رسد (احمدزاده، 1392).

 

1-9 باکتری­های محرک رشد گیاه (PGPRsها^[10])

باکتری­های ريزوسفري محرك رشد گياه (PGPR)به گروه نامتجانسي از ميكروارگانيزم­ها اطلاق مي­شوند كه سبب افزايش رشد گياه مي­شوند (وسی[11]، 2003). جنس­هاي متعددي از باكتري­ها به عنوان انواع محرك رشد گياه معرفي شده­اند. این باکتری­ها در بسياري از فرايندهاي كليدي بوم نظام از جمله كنترل بيولوژيكي پاتوژن­هاي گياهي، چرخه عناصر غذايي و استقرار گياهچه دخالت دارند و امروزه براي اهداف كشاورزي و جنگل­داري مورد توجه مي­باشند. اين باكتري­­ها ممكن است ريزوسفر، سطح ريشه و يا حتي فضاي بين سلولي را كلونيزه نمايند (مک کلی[12]، 2001).باكتري­هاي ريزوسفري محرك رشد گياه مي­توانند با استفاده از مكانيزم­هاي مختلفي به طور مستقيم و غيرمستقيم در افزايش رشد و عملكرد گياه نقش داشته­اند. در روش غيرمستقيم باكتري­هاي محرك رشد با استفاده از مكانيزم­هاي خاصي اثرات مضر بيماري­هاي گياهي را تعديل نموده و به اين طريق موجب افزايش رشد گياه مي­شوند. در روش مستقيم اين باكتري­ها با تثبيت آزادزي نيتروژن، توليد متابوليت­هاي موثر در رشد گياه، مانند هورمون­هاي گياهي (اكسين، سيتوكينين، جيبرلين)، انواع ويتامين­ها بخصوص ويتامين­هاي گروه B و انواع اسيدهاي آمينه مثل آرژنين، ليزين، تريپتوفان و بيوتين، افزايش حلاليت تركيبات نامحلول مثل فسفر و پتاسيم از طريق توليد اسيدهاي معدني و آلي، توليد سيدروفورها و افزايش فراهمي عناصر كم مصرف به ويژه آهن و توليد آنزيم ACC دآميناز موثر در كاهش اثرات سوء اتيلن تنشي به رشد بهتر گياه كمك مي­كنند (گلیک و همکاران[13]، 2001).

باكتري­هاي ريزوسفري محرك رشد گياه مي­توانند با استفاده از مكانيزم­هاي مختلفي به طور مستقيم و غيرمستقيم در افزايش رشد و عملكرد گياه نقش داشته باشند. در روش غيرمستقيم باكتري­هاي محرك رشد با استفاده از مكانيزم­هاي خاصي اثرات مضر بيماري­هاي گياهي را تعديل نموده و به اين طريق موجب افزايش رشد گياه مي­شوند. در روش مستقيم اين باكتري­ها با تثبيت آزادزي نيتروژن، توليد متابوليت­هاي موثر در رشد گياه، مانند هورمون­هاي گياهي (اكسين، سيتوكينين، جيبرلين)، انواع ويتامين­ها بخصوص ويتامين­هاي گروه B و انواع اسيدهاي آمينه مثل آرژنين، ليزين، تريپتوفان و بيوتين، افزايش حلاليت تركيبات نامحلول مثل فسفر و پتاسيم از طريق توليد اسيدهاي معدني و آلي، توليد سيدروفورها و افزايش فراهمي عناصر كم مصرف به ويژه آهن و توليد آنزيم ACC دآميناز موثر در كاهش اثرات سوء اتيلن تنشي به رشد بهتر گياه كمك مي­كنند (گلیک و همکاران[14]، 2001).

باكتري­هاي آزادزي خاك كه براي گياهان مفيد هستند، اغلب شامل تعدادي از باكتري­هاي مختلف نظير Azotobacter،Azospirillum،Pseudomonads ، Acetobacter،Burkholderia ، Bacilliو غیره هستند. باكتري­هايPGPR مي­توانند روي رشد و نمو گياه به دو طريق غير مستقيم و يا مستقيم تاثير داشته باشند. تحريك غيرمستقيم رشد گياه موقعي رخ مي­دهد كه باكتري­ها، برخي از اثرات مضر يك موجود بيماريزا را توسط يك يا چند مكانيسم كاهش داده يا از عمل آن جلوگيري به عملآورند. به عبارت ديگر، تحريك مستقيم رشد گياه توسطPGPR معمولاً شامل تامين گياه با يك تركيب سنتز شده توسط باكتري يا تسهيل جذب عناصر غذايي از محيط مي­باشد. چون بسياري از تركيبات شيميايي كه جهت جلوگيري از آفات و بيماري­ها در گياهان استفاده مي­شوند براي حيوانات و انسان خطرناك هستند و مي­توانند در اكوسيستم­هاي طبيعي ماندگار شده و تجمع پيدا كنند، بنابراين مواد شيميايي در حال جايگزين شدن با روش­هاي بيولوژيكي (استفاده ازPGPRبيوكنترل) بي­خطر براي محيط زيست جهت تحريك رشد گياه هستند (وسی، 2003). خصوصيات مرتبط با بيوكنترل عوامل بيماري­زاي گياهي عبارتند از:

1- سنتز آنتي­بيوتيك

2- ترشح سايدروفور (كلاته كننده آهن) جهت به دست آوردن آهن محلول از خاك و تامين آن براي گياه و بنابراين محروم كردن عوامل بيماري­زاي قارچي در كسب آهن محلول

3- توليد (باقری و همکاران، 1381)متابوليت­هاي با وزن مولكولي كم نظير هيدروژن سيانيد با فعاليت ضد­قارچي

4- توليد آنزيم­هاي كتيناز، بتا-1،‏3-گلوكاناز، پروتئاز يا ليپاز كه ديواره عده­اي از سلول­هاي قارچي را مي­توانند ليز كنند.

5- رقابت با عوامل بيماري­زاي گياهي براي عناصر غذايي و محل­هاي روي سطح ريشه

6- كاهش توليد اتيلن تنشي (ناشي از حمله عامل بيماري­زا در گياهان با آنزيم ACC دآميناز) (وسی، 2003).

 

1-10 مکانیسم عمل PGPR ­ها

باكتري­هاي ريزوسفري محرك رشد گياه مي­توانند با استفاده از مكانيزم­هاي مختلفي به طور مستقيم و غيرمستقيم در افزايش رشد و عملكرد گياه نقش داشته­اند. در روش غيرمستقيم باكتري­هاي محرك رشد با استفاده از مكانيزم­هاي خاصي اثرات مضر بيماري­هاي گياهي را تعديل نموده و به اين طريق موجب افزايش رشد گياه مي­شوند. در روش مستقيم اين باكتري­ها با تثبيت آزادزي نيتروژن، توليد متابوليت­هاي موثر در رشد گياه، مانند هورمون­هاي گياهي (اكسين، سيتوكينين، جيبرلين)، انواع ويتامين­ها بخصوص ويتامين­هاي گروه B و انواع اسيدهاي آمينه مثل آرژنين، ليزين، تريپتوفان و بيوتين، افزايش حلاليت تركيبات نامحلول مثل فسفر و پتاسيم از طريق توليد اسيدهاي معدني و آلي، توليد سيدروفورها و افزايش فراهمي عناصر كم مصرف به ويژه آهن و توليد آنزيم ACC دآميناز موثر در كاهش اثرات سوء اتيلن تنشي به رشد بهتر گياه كمك مي­كنند.اهمیت استفاده از PGPR ها برای گیاهان مختلف به عنوان کود زیستی هر روزه در حال افزایش می­باشد و تحقیقات وسیعی در این مورد در حال اجراست. اما امکان استفاده از این موجودات در تحقیقات آزمایشگاهی گیاهی از جمله کشت بافت گیاهی هنوز در حال بررسی است. با توجه به اینکه این میکروارگانیزم­ها انواع مواد را به محیط اضافه می­کنند، احتمال اینکه بر روی مراحل مختلف کشت بافت از ایجاد کالوس تا مرحله انتقال به خاک اثرات مثبتی داشته باشند وجود دارد. در این مورد گزارش­های بسیار اندکی موجود است و تحقیق بر روی این موضوع ضروری به نظر می­رسد. گلیک (2001) عوامل پروبيوتيك از نظر عملكرد به دو گروه اصلي تقسيم مي­شوند:

1- عواملي كه به‌طور مستقيم با مكانيزم‌هاي مختلف بر رشد گياهان و جوانه­زني بذور يا بهبود توليد محصولات تاثير مي‌گذارند.

2- عواملي كه از طريق كنترل بيمارگرهاي گياهي به‌طور غيرمستقيم براي رشد گياهان مفيد هستند.

 

<!--StartFragment--> <!--EndFragment-->

چکیده:

 

وجود رنگدانه­های آنتوسیانین در برنج عامل اصلی تولید پایه ساقه ارغوانی رنگ محـسوب می­شود. رنگ پایه ساقه در برنج رابطه مستقیم و قوی با تشکیل دانه­های رنگی در برنج دارد که در زیر پوسته آنها به دلیل تراکم متفاوت رنگیزه­های آنتوسیانین در لایه­های مختلف پریکارپ، پوشش دانه و آلورون، رنگ­های سرخ، ارغوانی و سیاه مشاهده می­شود. بمنظور درک درست از مسیر بیوسنتزی آنتوسیانین که اطلاعات مفیدی را در زمینه بیولوژی مولکولی و ژنتیک برنج به همراه خواهد داشت، الگوی تفرق ژن رنگ پایه ساقه با استفاده از تعداد 123 تک بوته از جمعیتF₂حاصل از تلاقی 18-33 - DNو ندا مورد مطالعه قرار گرفت. ارزیابی تک بوته­های F₂بر اساس رنگ پایه ساقه نشان داد تعداد 83 بوته رنگی (ارغوانی) و تعداد 40 بوته بی­رنگ تولید شده نسبت تفرق 1 :075/2 را ایجاد می­نماید. آماره c² این نسبت تفرق برابر 48/3 بود که از نسبت تفکیک 3:1 اختلاف معنی داری را نشان نداد (95/0p < ). در نتیجه ثابت شد که صفت مورد نظر از سیستم کنترل تک ژنی تبعیت می­نماید. مطالعات انجام شده با استفاده از 59 نشانگر مولکولی میکروساتلیت میزان 28 درصد چند شکلی بین والدین را نشان داد و آنالیز پیوستگی روی تک بوته­های مغلوب جمعیت F₂ از تلاقی ندا × 18-33 - DNثابت کرد که ژن رنگ پایه ساقه بر روی بازوی کوتاه کروموزوم شماره 6 برنج با نشانگرRM253 که در فاصله 15 سانتی مورگان از ژن قرار دارد همبسته مي باشد.

 

واژه­های كليدي:

برنج، رنگ ساقه، نشانگر­های SSR.

 

 

فهرست مطالب

عنوان صفحه

فصل اول

مقدمه

1-1- تولیدکنندگانبرنج2

1-2- کشتبرنجدرایران2

1-3- متابولیت­هایثانویهدرگیاهان3

1-4- تهیه نقشه­های ژنتیک4

 

فصلدوم

کلیاتومرورمنابع

2-1- مشخصاتگیاهشناسیبرنج7

2-2- وضعیتژنتیکیبرنج7

2-3- مهندسیتولیدمتابولیت­هایثانویهدرگیاهان8

2-4- ژن­هایمسئولبیوسنتزفلاوونوئیدهاوآنتوسیانین­ها9

2-5- برنجرنگی11

2-6- نشانگرهادربرنامه­هایاصلاحی12

2-6-1- تعریفنشانگر12

2-6-2- انواعنشانگرها13

2-6-2-1- نشانگرهایموفولوژیکی13

2-6-2-2- نشانگرهایسیتوژنتیکی13

2-6-2-3- نشانگرهایبیوشیمیایی14

2-6-2-4- نشانگرهایمولکولی14

2-6-2-4-1- نشانگرهایمولکولیمبتنیبرDNA 15

2-6-2-4-1-1- نشانگر­هایمولکولیمبتنیبرهیبریداسیون15

2-6-2-4-1-2- نشانگر­های مولکولی مبتنی بر واکنش زنجیره­ای پلیمراز16

2-6-2-4-1-3- نشانگرهای مولکولی مبتنی بر PCR و هیبریداسیون16

2-6-2-4-1-4- نشانگرهای مبتنی بر توالی­یابی (SNPها) و تراشه DNA17

2-7- کاربردنشانگرهایمولکولی17

2-8- انتخابمیانانواعمختلفنشانگرها19

2-9- کاربردنشانگرهایمولکولیدربرنج19

2-10- انتخاببهکمکنشانگرها21

2-11- استفادهازنشانگرهایمولکولیدرتهیهنقشهژنتیکی21

2- 12- ریزماهواره22

2-12-1- تشخیصآلل­هایریزماهواره24

2-12-2- مزایاینشانگرهایریزماهواره24

2-12-3- مشکلات کار با ریزماهواره25

2-12-3-1- اشتباهات آلل خوانی25

2-12-3-2- آلل­های صفر26

2-12-3-3- اندازهنمونهموردنیاز26

2-12-4- ریزماهواره­هادرگیاهانوبرنج27

2-12-5- کاربردهایریزماهواره28

2-13- نقشه­هایپیوستگیژنتیکی28

2-14- ویژگی­هاینقشه29

2-15- سابقهنقشهیابیصفترنگدربرنج30

2-15-1- ارتباط بین رنگ پریکارپ وصفت گلوتیوز33

2-15-2- توارث رنگ نوک دانه و ارتباط آن با صفات دیگر33

2-15-3- روابط بین رنگ کلالهبا صفات دیگر34

2-15-4- ارتباطات بین رنگ پوشبرگ و صفات دیگر34

2-15-5- ارتباط بین رنگ کلاله و رنگ پوشبرگ35

2-15-6- ارتباط بین رنگ زبانک با صفات دیگر35

2-15-7- ارتباطات بین رنگ زبانک و رنگ پریکارپ35

2-15-8- نشاندار کردن ژن­های مهم اقتصادی و انتخاب به کمک نشانگر (همراه)36

2-15-9- مطالعه ژنتیکی و نشاندارکردن ژن صفت رنگ در برنج37

فصل سوم

مواد و روشها

3-1- مواد گیاهی41

3-1-1- رقم 18-33DN-41

3-1- 2- رقم ندا42

3-2- کشت والدین و جمعیت F₂43

3-3- تهیه نمونه برگی43

3-4- ارزیابی صفت44

3-5- استخراج DNA44

3-5-1- روش استخراج DNA45

3-6- بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده49

3-6-1- ازطریق اسپکتروفتومتر49

3-6-2- به وسیله الکتروفورز ژل آگارز49

3-7- بارگذاری نمونه­ها و اجرای الکتروفورز50

3-8- آماده سازی آغازگرهای ریزماهواره51

3-9- انجامواکنش PCR53

3-10- تجزیه وتحلیل داده ها54

 

فصل چهارم

نتایج و بحث

4-1- ارزیابی فنوتیپی57

4-2- ارزیابی مولکولی58

4-2-1- غربال والدین58

4-2-2- تحلیل لینکاژ60

4-3-ارزیابی نشانگر RM253 در ارقام دیگر برنج64

 

فصل پنجم

پیشنهادات68

 

منابع70

 

ضمائم

لیست پرایمرهای بکار رفته در پژوهش79

تهیه محلول­های مادری81

ماتریس داده­های مولکولی و فنوتیپی83

 

چکیده انگلیسی

 

فهرست شکل­ها

عنوان صفحه

شکل 3-1. لاین 18-13-DN.. 41

شکل 3-2. والد 18-13-DN باپایه ساقه سبز رنگ.. 42

شکل 3-3. لاین ندا.. 42

شکل 3-4. والد ندا با پایه ساقه ارغوانی رنگ.. 43

شکل3-5. عملیات نمونه برداری از نمونه­های برگی برنج دو هفته پس از نشاء 44

شکل 3-6. پودر کردن نمونه­های برگی با استفاده از ازت مایع.. 46

شکل 3-7. سانتریفیوژ کردن نمونه­ها.. 47

شکل 3-8. تشکیل سه فاز مشخص پس از افزودن کلروفرم و جدا نمودن فاز رویی 47

شکل 3-9. تشکیل کلاف DNA پس از مصرف ایزوپروپانول.. 48

شکل 3-10. افزودن TE به رسوب DNA و نگهداری آنها در فریزر 20-.. 48

شکل 3-11 . بارگذاری نمونه ها در ژل آگارز.. 51

شکل3-12 . نمونه هایی ازDNA ژنومی که به روشCTAB استخراج شده است... 52

شکل3-13. عملیات انجام PCR.. 54

شکل 4-1. الگوی نواربندی بین والدین مورد مطالعه با تعدادی از نشانگرهایSSR مورد مطالعه.. 60

شکل 4-2. الگوی نوار بندی بین والدین مورد مطالعه با تعدادی از نشانگرهای SSR مورد مطالعه.. 60

شکل 4-3. الگوی نواربندی بین والدین مورد مطالعه در 10 گیاه دارای پایه ساقه سبز با استفاده از نشانگرRM1358.. 61

شکل4-4. الگوی نواربندی بیـن والدین مورد مطالعـه در گیاهان دارای پایـه ساقه سـبز و ارغوانـی بـا استفاده ازنشانگر RM443.. 62

شکل 4-5. الگوی نواربندی بین والدین مورد مطالعه با 10 گیاه با پایه ساقه سبز با استفاده از نشانگر RM253.. 62

شکل4-6. نحوه تعیین ژنوتیپ تعدادی از محصولات واکنـش زنجیره­ای پلیمراز نشـانگر RM253 در جمعیـتی از بوته­های F2 بر روی ژل آگارز.. 63

شکل 4-7 .آنالیز ارقام دارای پایه­های ارغوانی و سبز با پرایمر RM253.. 65

شکل 4-8. نقشه ژنتیکی نشانگر RM253 روی بازوی کوتاه کروموزوم 6.. 66

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول2-1. لیست ژن­های نشاندار شده توسط مارکرهای مولکولی در برنج.. 38

جدول3-1. درجه حرارت و زمان بهینه شده در مراحل مختلف واکنش PCR.. 54

جدول3-2. مقادیر بهینه شده مواد واکنش زنجیره ای پلیمراز.. 55

جدول 4-1. آماره محاسباتی c2 با درجه آزادی 1 برای صفت رنگ پایه ساقه در جمعیت F2.. 57

جدول 4-2. نشانگرهای پلی­مورف به کار رفته در این تحقیق.. 59

جدول 4-3. آزمـون2c بـرای مقایـسـه فـراوانی­های ژنوتیپی نشـانگر RM253 با فراوانی­های مورد انتظار 1:2:1 در جمعـیت F2.. 63

 

فصل اول

مقدمه

 

1-1- تولید کنندگان برنج

برنج پس از گندم دومین غله مهم در دنیا به حسـاب می­آید و به عنوان یکی از مهمترین محصولات استراتژیک جهان از اهمیت و جایگاه ویژه­ای برخوردار است، نزدیک به 90 درصد سطح زیر کشت و تولید برنج متعلق به کشورهای خاور دور می­باشد. بیش از نصف محصول برنج دنیا در دو کشور هند و چین تولید می­شود. به طور کلی، کشورهای گرمسیری و نیمه گرمسیری برمه، تایلند، ویتنام، لائوس، اندونزی، فیلیپین، پاکستان، هند، آمریکا، ژاپن، ایتالیا، مصر، چین، برزیل، کوبا، مکزیک و استرالیا از تولیدکنندگان عمده برنج به شمار می­آیند. میزان تولید برنج در تایلند، برمه، ویتنام و لائوس بیش از مصرف داخلی آنهاست و بنابراین نزدیک به 90 درصد برنج موجود در بازارهای دنیا متعلق به این 4 کشور می­باشد (53).

1-2- کشت برنج در ایران

کشت برنج در ایران در نواحی شمالی و در نواحی جنوبی به ویژه خوزستان تاریخچه طولانی دارد. شواهد نشان می­دهد که این محصول در این ناحیه، قرنها پیش از میلاد مسیح و در زمان هخامنشیان رواج داشته است. در ایران اسلامی نیز علی رغم دستاوردهای خوب تحقیقاتی و قریب به 600 هکتار زیر کشت برنج، متاسفانه به دلیل استفاده ناصحیح و توسعه محدود ارقام اصلاح شده و با توجه به رشد روز افزون جمعیت ایران، تولید داخلی برنج پاسخگوی نیاز مردم نیست و مقادیر قابل توجهی از خارج وارد می­شود. افزایش تولید به دو روش افزیش سطح زیر کشـت و افزایش در واحد سطـح امـکان­پذیر می­باشد. بدلیل محدود بودن زمین­های زراعی و نیز کمبود شدید آب، بدون تردید باید تولید را در واحد سطح با استفاده از روش­های به­زراعی و به­نژادی افزایش داد. دستیابی به خودکفایی در تولید برنج و حفظ ثبات قیمت آن، از جمله اهداف مهم در کشورهای کم درآمدی است که برنج بعنوان تنها غذای اصلی، اساس تأمین نیازهای غذایی بوده و برای مردم فقیر و آسیب پذیر این کشورها شغل و درآمد ایجاد می­نماید(53).

1-3- متابولیت­های ثانویه در گیاهان

بعضی از موجودات زنده خصوصاً گیاهان، طیف وسیعی از ترکیبات موسوم به متابولیت­های ثانویه را تولید می­کند. در مفهوم کلی، متابولیت­های ثانویه ترکیبات آلی هستند که نقش ضروری در رشد و نمو موجود زنده ندارند. با مطالعاتی که تا کنون صورت گرفته است، به نظر می­رسد که متابولیت­های ثانویه به عنوان مواد طبیعی نقش اکولوژیکی مهمی در واکنش­های دفاعی گیاهان و همچنین گرده افشانی و انتشار دانه­های گیاهان به وسیله حشرات و حیوانات دارند. بعضی از این ترکیبات به عنوان علف­کش و حشره کش در صنعت استفاده می­شوند در حالی که برخی دیگر کاربرد صنعتی ندارند. دسته بزرگی از متابولیت های ثانویه کاربرد دارویی و پزشکی دارند. ترکیبات دیگری از این گروه نیز نقش مهمی در تغذیه انسان و دام و كیفیت مواد غذایی (رنگ، طعم و بو) مختلف دارند (72).

به دلیل كاربردهای فراوان، متابولیت­های ثانویه موضوع جالبی برای تحقیقات اصلاح نباتات از طریق روش­های مولكولی و مهندسی ژنتیـك محسـوب می­شوند. مطالعه در زمینه وظایف این تركیبات در گیاهان، یك موضوع جالب و مهم برای بسیاری از پروژه­های تحقیقاتی شده است و نقش تعدادی از این تركیبات مورد بررسی و تحقیق قرار گرفته است.

در ده سال گذشته تحقیقات چندانی در ارتباط با متابولیت­های ثانویه انجام نشده است. مانع بزرگ در انجام این تحقیقات اطلاعات اندك از مسیرهای تولید زیستی متابولیت­های ثانویه و برهم كنش آنزیم­های درگیر در این مسیر همچنین اطلاعات محدودی از ژن­های مربوط به متابولیت­های ثانویه در دسترس است. یكی از مسیرهایی كه مطالعات بیشتری در سطح ژن­های دست اندركار آن نسبت به دیگر متابولیت­های ثانویه انجام شده است، مسیـر تولید فلاوونوئیدها و آنتوسیـانین­ها است (20). اكثـر ژن­های درگیر در مسیر تولید آنتوسیانین­ها همسانه­سازی شده و مطالعات فراوانی در سطح بیوشیمیایی، مولكولی و ژنتیك این دست از متابولیت­های ثانویه صورت گرفته است. یكی از مهمترین دلایل مطالعات بیشتر در این زمینه، آسانی بررسی این مواد از روی رنگ گل­ها، نوک دانه و پایه ساقه در گیاهانی همچون برنج است که بر اساس فنوتیپ قابل ارزیابی است (73). هدف از مهندسی ژنتیك مسیر یك متابولیت ثانویه، افزایش مقدار یك ماده خاص یا گروهی از تركیبات و یا حتی كاهش مقدار این تركیبات است. برای دستیابی به هدف دوم كه كاهش میزان تولید یك ماده خاص یا گروهی از مواد ناخواسته است، راه­های مختلفی وجود دارد. این مواد ممكن است تركیبات سمی در یك محصول گیاهی، مواد مانع خالص سازی یك فرآورده صنعتی یا موادی از این دست باشد. یكی از این راه­ها، مسدود كردن یك مرحله از مسیر تولید متابولیت ثانویه و مختل كردن تولید یا فعالیت آنزیم مربوط به آن مرحله است. این هدف می­تواند با كاهش میزان mRNA مسئول تولید این آنزیم، با استفاده از فناوری آنتی­سنس، RNAi یا بیان بالای یك آنتی­بادی علیه آنزیم مسئول محقق شود. فناوری آنتی­سنس برای تغییر رنگ به طور گسترده­ای استفاده شده است. راه­های دیگر دستیابی به این هدف، تغییر مسیر به سوی مسیرهای موازی یا افزایش كاتابولیسم محصول نهایی است. اما ممكن است هدف از انجام تحقیقات، افزایش تولید یك تركیب خاص در گیاه بوده یا انتقال ژن­های مربوط به مسیر تولید یك متابولیت ثانویه به یك گیاه یا یك ریزسازواره مورد نظر باشد. همچنین ممكن است تولید یك ماده جدید كه به صورت طبیعی در گیاهان تولید نشود هدف یك پروژه تولیدی- پژوهشی باشد. در بـرخی روش­ها با تغییر میزان بیان یك یا چند ژن، بر موانع تولید یك ماده غلبه می كنند و در روش های دیگر، با حذف مسیرهای موازی (رقابتی) یا كاهش كاتابولیسم ماده مورد نظر، مقدار آن ماده را در گیاه می­افزایند. ایجاد تغییراتی در بیان ژن­های تنظیمی كه كنترل مسیر تولید زیستی متابولیت­های ثانویه را برعهده دارند نیز از جمله روش­های افزایش یا كاهش تولید تركیب مورد نظر است.

1-4- تهیه نقشه­های ژنتیک

ریشه بسیاری از محدودیت­های روش­های مختلف اصلاح نباتات، نبود زیر بنا و مقدمات ضروری اساسی برای مطالعات ژنتیک است. یکی از اجزای کلیدی و زیر بنایی و ابزار اساسی مورد نیاز برنامه-های آینده اصلاح نباتات، تهیه نقشه­های ژنتیک است. شاید یکی از مهم­ترین کاربرد نشانگرهای DNA تهیه نقشه-های ژنتیک باشد که براساس آن می­توان جایگاه ژنی و کروموزومی ژن­های تعیین کننده صفات مطلوب (ترتیب و فاصله ژن­ها و نشانگرها از یکدیگر بر روی کروموزوم ها) را تعیین کرد.

با دانستن جایگاه یک ژن روی نقشه ژنتیک، می­توان از نشانگرهای مجاور آن برای احراز جود یک صفت متناظر استفاده کرد. بدین ترتیب نیازی به انتظار برای ظهور آثار ژن نیست. با استفاده از نشانگرهای DNA می توان صفات و مشخصات آینده یک نشای برنج را پیش بینی کرد. در نتیجه تاثیری مثبتی بر اصلاح و پیشبرد گیاه دارد.

هدف از این پژوهش، مطالعه ژن کنترل کننده رنگ پایه ساقه در ژنوم برنج و شناسایی جایگاه­ ژنومی آن از طریق مارکرهای همبسته و ارزیابی نشانگرهای مولکولی ریزماهواره در شناسایی ارقام دارای ژن کنترل کننده رنگ پایه ساقه می­باشد. این مطالعه پیش نیاز مطالعات مولکولی بوده و مواد اصلاحی با ارزشی را برای آنها از طريق شناسایی نشانگرهای مولکولی همبسته با ژن فراهم می­آورد.

 

 

 

 

عنوان مقاله : الکترونیک مولکولی

قالب بندی : Word

تعداد صفحات 28

شرح مختصر : الکترونیک مولکولی یک رویکرد جدید است که به مواد اولیه و اصول عملکرد جدید نیاز دارد و می‌توان گفت انگیزه‌ای برای شناخت و استفاده از آنچه در مولکول‌های مواد اتفاق می‌افتد است. در مقیاس‌های کوچک تر از نانو، ایده استفاده از یک یا چند مولکول به‌عنوان یک سوئیچ به‌نظر بسیار جالب‌تر از بررسی بن‌بست‌های ماسفتی می‌باشد. این کار علاوه بر کوچک شدن ابعاد سرعت را بسیار زیاد کرده است همچنین ارزان‌تر است و بالطبع آن روش‌ها و پیچیدگی‌ها بسیار دشوار می‌شود. (الکترونیک مولکولی هنوز در حال تحقیق در مورد روش‌های ساخت می‌باشد. که به‌نظر می‌رسد به زودی بر آن غلبه و به سمت ساخت مدار مجتمع با این تکنولوژی برود)

همان طور که می‌دانیم روش لیتوگرافی نوری برای ساخت مدارات الکترونیکی مجتمع با چالش‌های اساسی و جدی روبرو شده است. محدودیت‌های فناوری از یک سو و چالش‌های کوانتومی از سوی دیگر توسعه‌ی نانوالکترونیک را با دشواری روبرو کرده است . در این میان دانشمندان به ایده‌ها و روش‌های جایگزین و جدیدی می‌اندیشند که محدودیت‌های روش لیتوگرافی نوری را ندارد. یکی از این روش‌ها، ساخت و استفاده از مولکول‌هایی است که رفتاری مشابه رفتار کلید زدن ترانزیستورها داشته باشند. در واقع دانشمندان قصد دارند با طراحی، ساخت و استفاده از این مولکلول‌ها، آن‌ها را جایگزین ترانزیستورهای سیلیکونی کنند. این ایده را الکترونیک مولکولی می‌گوییم. این رفتار می‌تواند مبنایی برای پردازش اطلاعات در رایانه‌ها و ذخیره‌ی اطلاعات در حافظه‌ها قرار گیرد .

مولکول‌هایی که در الکترونیک مولکولی مورد استفاده قرار می‌گیرند بایستی شرایطی داشته باشند. این مولکول‌ها باید دارای دو شکل متفاوت باشند که توسط یک محرک خارجی نظیر نور یا ولتاژ تغییر شکل دهد. این تغییر شکل باید برگشت‌پذیر هم باشد. در واقع مولکول در یک حالت به عنوان صفر (zero) و در یک حالت به عنوان یک (one) رفتار می‌کند. رفتار برگشت‌پذیری مولکول هم باید بسیار سریع باشد به گونه‌ای که بتواند در مدارات الکترونیکی مجتمع، مفید واقع شود. همچنین پایداری و مخصوصا پایداریِ گرمایی نیز عامل مهمی است. یعنی این مولکول‌ها در برابر تغییرات دمایی نباید از شکلی به شکل دیگر تغییر شکل دهند. چرا که در مدارات مجتمع محدوده‌ی تغییرات دمایی بسیار زیاد است و در صورت تغییر شکل مولکول‌ها، اطلاعات آن‌ها از دست می‌رود.

مثلا مولکول آزوبنزن ، در ابتدا نمونه‌ای مناسب به نظر می‌رسد. مولکول آزوبنزن دارای دو ایزومر سیس و ترانس است که هر کدام دارای دو طول متفاوت است. با تابیدن نور فرابنفش با طول موج ۳۱۳ نانومتر، ایزومر ترانس به ایزومر سیس تغییر شکل می‌دهد و با تابیدن نور فرابنفش با طول موج بیش‌تر از ۳۸۰ نانومتر، ایزومر سیس به ایزومر ترانس تغییر شکل می‌دهد. بنابراین در مدار الکتریکی یکی از ایزومرها می‌تواند به عنوان صفر و دیگری به عنوان یک رفتار کند. لیکن مشکل آزوبنزن عدم پایداری گرمایی آن است. در واقع ایزومر سیس آزوبنزن از نظر گرمایی پایدار نیست و اندک گرمایشی موجب تغییر شکل آن به ایزومر ترانس می‌شود.

البته این رفتار در مولکول مذکور در دمای ۶۰ کلوین مشاهده می‌شود، یعنی تقریبا ۲۱۳- درجه‌ی سلسیوس و در دمای اتاق ظاهر نمی‌شود. همان طور که مشاهده می‌کنید این دما بسیار پایین و دسترسی به آن دشوار است. لذا استفاده از آن در شرایط دمای معمولی مستلزم توسعه‌ی بیش‌تر این دانش است. همچنین لازم به یادآوری است که نشان دادن این که یک مولکول می‌تواند جریان الکتریکی را هدایت کند و رسانایی و عدم رسانایی آن قابل کنترل است، برای توسعه‌ی دانش الکترونیک کفایت نمی‌کند. آن چه اکنون در اختیار داریم یک کلید مولکولی بسیار کوچک و در ابعاد چند نانومتر است که جریان الکتریکی عبوری از آن با استفاده از یک ولتاژ قابل کنترل است. مزیت اصلی آن نسبت به ترانزیستورهای سیلیکونی ابعاد کوچک‌ترِ آن است. لیکن توسعه‌ی رایانه‌ها و استفاده از الکترونیک مولکولی در صنایع الکترونیک و رایانه مستلزم اتصال این مولکول‌ها به یکدیگر و ساخت گِیت‌های منطقی است همچنین روش‌های ساخت و تولید آن در مقیاس انبوه نیز چالشی است که باید قبل از توسعه‌ی الکترونیک مولکولی حل شود

فهرست :

تعریف کلی از الکترونیک تک مولکولی

مزایا و معایب نسبت به دیگر فناوری ها

برنامه های کاربردی الکترونیک تک مولکولی

بررسی و مقایسه اندازه تراشه ها

هدایت یک اتصال مولکولی

ابزارهای کاربردی برای بررسی پارامترها و ساختارالکتریکی

انتقال الکترون از طریق تک مولکول (رسانایی)

ترازهای فرمی از الکترودها و مرز اوربیتال مولکولی

نحوه ی برقراری اتصالات در الکترونیک مولکولی

سیم های مولکولی

دیود های مولکولی

ریکتیفایر مولکولی

ترانزیستور مولکولی

سوئیچ مولکولی

گیت های منطقی مولکولی

 

عنوان مقاله : انرژی هسته ای از ابتدا تا انتها

قالب بندی : Word

تعداد صفحات 51

شرح مختصر : انرژي يکي از مهمترين نياز هاي جامعه امروزي است ، از آنجايي که استحصال انرژي از منابع سوخت فسيلي براي بشر و محيط زيست او ، به دليل ايجاد گازهاي گلخانه اي ، زيان هاي جبران ناپذيري را به همراه دارد ، اين روزها جامعه بشري به دنبال جايگزين هاي نويني از انرژي است . از مناسب ترين آنها مي توان به انرژي هسته اي نهفته در هسته اتم ها اشاره کرد ،که اين انرژي بيش از 5 دهه است که مورد بهره برداري قرار دارد . استفاده از نیروی هسته‌ای از 50 سال پیش آغاز شد و اینک این نیرو همان اندازه از برق جهان را تأمین می‌کند که 40 سال پیش بوسیله تمام منابع انرژی تأمین می‌شد. حدود دو سوم از جمعیت جهان در کشورهایی زندگی می‌کنند که نیروگاههای هسته‌ای آنها در زمینه تولید برق و زیر ساختهای صنعتی نقش مکمل را ایفا می‌کنند. نیمی از مردم جهان در کشورهایی زندگی می‌کنند که نیروگاههای هسته‌ای در آنها در حال برنامه‌ریزی و یا در دست ساخت هستند. به این ترتیب ، توسعه سریع نیروی هسته‌ای جهان مستلزم بروز هیچ تغییر بنیادینی نیست و تنها نیازمند تسریع راهبردهای موجود است. امروزه حدود 440 نیروگاه هسته‌ای در 31 کشور جهان برق تولید می‌کنند. بیش از 15 کشور از مجموع این تعداد در زمینه تأمین برق خود تا 25 درصد یا بیشتر ، متکی به نیروی هسته‌ای هستند. در اروپا و ژاپن سهم نیروی هسته‌ای در تأمین برق بیش از 30 درصد است، در آمریکا نیروی هسته‌ای 20 درصد از برق را تأمین می‌کند. در سرتاسر جهان ، دانشمندان بیش از 50 کشور از حدود 300 راکتور تحقیقاتی استفاده می‌کنند تا درباره فناوریهای هسته‌ای تحقیق کرده و برای تشخیص بیماری و درمان سرطان ، رادیوایزوتوپ تولید کنند.همچنین در اقیانوسهای جهان راکتورهای هسته‌ای نیروی محرکه بیش از 400 کشتی را بدون اینکه به خدمه آن و یا محیط زیست آسیبی برسانند، تأمین می‌کنند.

 

فهرست مطالب :

کاربرد انرژی هسته ای

امنیت نیروگاه هسته‌ای

نگرانی‌های محیط زیستی

امتیاز و برتری انرژی هسته‌ای

اولین واکنش ذ نجیره ای خود تقویت شونده

پیشرفت انرژی هسته ای برای مقاصد صلح آمیز

انرژی هسته ای در ایران

اورانیوم

منابع اورانیم

آسياب كردن اورانيوم

اكتشاف و استخراج و تغلیظ اورانیم

خواص اشعه راديواكتيو

خواص ذره آلفا

خواص ذره بتا

خواص اشعه گاما

کیک زرد چیست؟

روش تهیه کیک زرد

مواد تشکیل‌دهنده کیک زرد

کاربردهای کیک زرد

غنی سازی اورانیم

روشها ي جداسازي و غني سازي ايزوتوپ اورانيوم

روش انتشار گازی دیفیوژن

روش سانتریفیوژ گازی

تاريخچه بمب اتم

تقسیم بندی انرژی انفجار سلاح اتمی

بازفرآوری سوخت

راکتور های هسته ای

رآکتور آب تحت فشار

رآکتور آب جوشان

انرژی شکافت هسته‌ای

راکتورهای تحقیقاتی تانکی

مزایای راکتور های زاینده سریع

راکتورهاي آب سبک تحت فشار

راکتور هاي خنک شونده با گاز

راکتور هاي آب سنگين تحت فشار

واکنش هاي دوتريم- تريتيم

ساختار همجوشی هسته ای:

سوخت های همجوشی

مدیریت زباله های هسته ای

پسمان هاي هسته اي

 

دانلود کتاب دامپروری عمومی

 

 

اين فايل حاوی گزارش ارزیابی آثار اجتماعی حفظ و احیای باغستان های سنتی شهر قزوین می باشد که با فرمت PDF در144 صفحه در اختيار شما عزيزان قرار گرفته است، در صورت تمايل مي توانيد اين محصول را از فروشگاه خريداري و دانلود نماييد.

 

فهرست مطالب :‌

فصل اول- کلیات پژوهش

شرح و بیان مسئله
تعریف ارزیابی تأثیرات اجتماعی (اتا)
اهداف، ضرورت و سؤالات تحقیق
اهداف
ضرورت و اهمیت تحقیق
سوالات تحقیق
روش تحقیق
رویکردهای نظری و مدل مفهومی پیش بینی پیامدها
مراحل انجام اتا
متغیرها و گونه های ارزیابی پیامدهای اجتماعی
مبانی و مراحل انجام ارزیابی طرح
ساختارگزارش

فصل دوم- توصیف و شناسایی ابعاد پروژه

آشنایی با باغات
تعریف باغ
تاریخچه و سبکهای باغسازی در ایران
بررسی علل و عوامل موثر در تخریب باغات وفضای سبز شهری
بررسی دید گاه ها و نظرات مختلف در برخورد با مسئله باغات
حفاظت و انواع آن
توسعه پایدار و حفاظت زیست محیطی
رویکرد انتقال حقوق توسعه
مکانیزم استفاده از رویکرد انتقال حق توسعه TDR
مفاهیم پایه و تعاریف
توصیف و شناسایی ابعاد پروژه
سوابق و موقعیت باغستان های سنتی قزوین
پوشش گیاهی باغات سنتی
عوامل موثر بر شکل گیری باغستان در شهر قزوین
عوامل تخریب باغستان های قزوین
اهم کاربریهای زمین و سازمانها و نهادهای مستقر در اطراف پروژه
کاربری های درون باغات
جایگاه پروژه در طرح های جامع شهری و تأثیربر استراتژی کلی توسعه شهر
تعیین حوزه جغرافیایی نفوذ و تأثیر طرح
اقدام توسعه ای صورت گرفته
خلاصه گزارش طرح حفظ و احیای باغستان های سنتی
وضع موجود باغستان های سنتی قزوین
وضع مطلوب باغستان های سنتی قزوین
دامنه یابی
محدوده تأثیر اولیه
محدوده تأثیر ثانویه
تأثیرات انباشتی
ذی نفعان اصلی پروژه
بازندگان پروژه
مطالعات تطبیقی
نمونه خارجی
باغات شهر نیویورک
نمونه داخلی
باغات قصرالدشت شیراز

فصل سوم - جمع آوری اطلاعات پایه و برآورد تأثیرات احتمالی

شناسایی تأثیرات اجتماعی
روش تحقیق و ابزارهای پژوهش
ابزار پژوهش
منابع جمعآوری دادههای اسنادی
جامعه آماری و حجم نمونه
روش تجزیه و تحلیل اطلاعات
تدوین سوالات پرسشنامه تحقیق
مصاحبه
نتایج حاصل از مصاحبه با مسئولین
نتایج حاصل از مصاحبه با باغداران
تحلیل نتایج کمی
گزارش برآورد و تحلیل تاثیرات
فواید باغات سنتی
میزان رضایت از شهرداری
اثرات اجتماعی مثبت باغات سنتی
تاثیر منفی باغات بر زندگی ساکنان نزدیک باغات
عواملی که سبب از بین رفتن باغات سنتی می شود
میزان تمایل به مشارکت
عواملی که سبب استفاده بیشتر از فضای سبز می شود
چندین روش برای برخورد با باغات
روش TDR
تبدیل تمام یا بخشی از باغات به باغ ویلا
استفاده برای توسعه مسکونی متراکم

فصل چهارم- شناسایی تأثیرات وارده بر ذی نفعان، سناریوسازی و ارائه راهکارهای پیشنهادی

ماتریس برآورد پیامدها
سناریوهای سه گانه
سناریوی بد بینانه
سناریوخوش بینانه
واقع بینانه
راهکارهای تعدیل، اصلاح و نظارت پیامدهای حفظ و احیای باغستان های سنتی قزوین
راه کارهای افزایش مشارکت عمومی در حفظ و احیای باغستان های سنتی
راه کارهای فرهنگی(اطلاع رسانی)
راه کارهای اجتماعی
پیشنهادهایی به سازمان باغستان ها

منابع

 

 

فهرست مطالب

عنوان . صفحه

چکیده 1

مقدمه 2

اهداف تحقیق 4

فصل اول-کلیات

1-1 تراکم کاشت 5

1-2 عنصرهای غذایی 6

1-2-1 تقسیم بندی عناصر غذایی 7

1-2-2 رابطه درجه فراهمی عناصربا pH 7

1-3 عنصر آهن 8

1-3-1 نقش آهن در زندگی گیاه 8

1-3-2 منابع کودهای محتوی آهن 9

1-3-3 علائم کمبود آهن 10

1-4 ویژگی های گیاه کلزا 10

1-5 تاریخچه 13

1-6 ویژگی های گیاه شناسی 18

1-7 خصوصیات مورفولوژیکی کلزا 18

1-8 اجزای عملکرد فیزیولوژیکی گیاه 21

1-9 ترکیب مواد تشکیل دهنده دانه 22

1-10 کیفیت دانه – میزان روغن 23

1-11 خواص تغذیه ای روغن کانولا 24

1-12 اصول کلی شناسایی روغن ها و چربی های خوراکی 28

1-13 تاثیر آب و هوا بر روی کیفیت دانه روغنی کلزا 28

1-14 ترکیبهای کنجاله کلزا 29

1-14-1 ترکیب های نا مطلوب موجود در کنجاله کلزا 30

1-15 اصول فراوری دانه کلزا برای تولید کنجاله و روغن 31

1-15-1 پوست گیری 32

1-15-2 فلس سازی 32

1-16 کلزا 35

1-16-1 تناوب 35

1-16-2 اثرات مثبت زراعت کلزا در تناوب 35

1-16-3 انتخاب رقم 35

1-16-4 ویژگی های خاک 36

1-16-5 تهیه زمین 36

1-16-6 تاریخ کاشت 36

1-16-7 عمق کاشت 37

1-16-8 آبیاری 38

1-16-9 برداشت 39

1-16-10 عملکرد کلزا 39

فصل دوم–بررسی منابع

2-1 تراکم کاشت 41

2-2 آهن 49

فصل سوم– مواد و روشها

3-1 مواد آزمایش 53

3-1-1 مشخصات محل اجرای آزمایش 53

3-1-2 خصوصیات خاک محل آزمایش 54

3-2 تیمارها 55

3-2-1 تراکم بوته 55

3-2-2 کود آهن 55

3-2-3 رقم و خصوصیات آن 55

3-3 روش آزمایش 56

3-3-1 مشخصات طرح آزمایش 56

3-3-2 مراحل اجرای آزمایش 56

3-3-2-1 کاشت 56

3-3-2-2 داشت 57

3-3-2-3 برداشت نهایی 59

3-4 بررسی صفات مربوط به عملکرد و اجزاء عملکرد 59

3-4-1 عملکرد دانه در واحد سطح 59

3-4-3 تعداد غلاف در بوته 60

3-4-4 تعداد دانه در غلاف 60

3-4-5 وزن هزار دانه 60

3-4-6 درصد روغن 60

3-4-7 تجزیه آماری دا 61

فصل چهارم –نتایج و بحث

4-1 تجزیه واریانس و مقایسه میانگین صفات مورد بررسی در کلزا 62

4-1-1 مقایسه میانگین های صفات مورد مطالعه 62

4-2 صفات مورد مطالعه در بوته کلزا در تراکم ها و سطوح مختلف کود آهن 66

4-2-1 تعداد غلاف در بوته کلزا 66

4-2-2 تعداد دانه در بوته 69

4-2-3 تعداد غلاف در شاخه اصلی 73

4-2-4 تعداد غلاف در شاخه فرعی 75

4-2-5 ارتفاع بوته 78

4-2-6 وزن هزار دانه 80

4-2-7 عملکرد دانه 83

4-2-8 درصد روغن 87

نتیجه گیری نهایی 90

پیشنهادات91

فهرست منابع 93

فهرست جداول

عنوانصفحه

جدول شماره 1-1- میانگین 5 ساله 1989 تا 1993 تولید روغن کلزا در کشورهای مختلف 15

جدول شماره 1-2- عملکرد کلزا در کشورهای مختلف دنیا ( کیلو گرم در هکتار ) 15

جدول شماره 1-3- سطح زیر کشت و میزان تولید دانه روغنی کلزا در ایران سالیان اخیر 16

جدول شماره1-4-سطح زیر کشت و میزان تولید کلزا در شهرستان ممسنی سالیان اخیر 17

جدول شماره 1-5- تولید جهانی دانه های روغنی مهم درسالهای گذشته 25

جدول شماره 1-6- تولید جهانی کنجاله دانه های پروتئینی مهم 25

جدول شماره1- 7-: میانگین میزان ترکیبهای دانه کلزای ایران در 5 سال گذشته 26

جدول شماره1-8- مقایسه ترکیبهای کلزا در کنجاله ایرانی و کانادایی 27

جدول شماره1-9- ترکیب اسید های چرب کلزا 32

جدول شماره 1-10- ترکیب مواد معدنی موجود در دانه کلزا 34

جدول شماره 3-1- نتایج حاصل از تجزیه خاک مزرعه 54

جدول شماره 4-1- مقایسه میانگین های صفات مورد بررسی کلزا در تراکم های مختلف 63

جدول شماره 4-2- مقایسه میانگین های صفات مورد بررسی کلزا در سطوح مختلف کود آهن 64

جدول شماره 4-3- مقایسه میانگین اثر متقابل تراکم بوته و سطوح کود آهن بر صفات بررسی 65

جدول شماره 4-4- نتایج تجزیه واریانس تعداد غلاف در بوته در سطح پنج درصد 66

جدول شماره 4-5- نتایج تجزیه واریانس تعداد دانه در کلزا در سطح پنج درصد 70

جدول شماره 4-6- نتایج تجزیه واریانس تعدادغلاف در شاخه اصلی در سطح پنج درصد 73

جدول شماره 4-7- نتایج تجزیه واریانس تعدادغلاف در شاخه فرعی در سطح پنج درصد 76

جدول شماره 4-8- نتایج تجزیه واریانس ارتفاع کلزا در سطح پنج درصد 78

جدول شماره 4-9- نتایج تجزیه واریانس وزن هزار دانه در کلزا در سطح پنج درصد 81

جدول شماره 4-10- نتایج تجزیه واریانس عملکرد دانه در کلزا در سطح پنج درصد 83

جدول شماره 4-11- نتایج تجزیه واریانس درصد روغن در سطح پنج درصد 87

فهرست نمودارها

عنوانصفحه

نمودار شماره 4-1- مقایسه میانگین اثر تراکم بوته بر تعداد غلاف در بوته 67

نمودار شماره 4-2- مقایسه میانگین اثر سطوح مختلف کود آهن بر تعداد غلاف در بوته 68

نمودار شماره 4-3- مقایسه میانگین اثر متقابل سطوح کود آهن و تراکم بوته بر تعداد غلاف 69

نمودار شماره 4-4- مقایسه میانگین اثر تراکم بوته بر تعداد دانه در بوته 71

نمودار شماره 4-5- مقایسه میانگین اثرسطوح کود آهن بر تعداد دانه کلزا 72

نمودار شماره 4-6- مقایسه میانگین اثر متقابل سطوح کود آهن و تراکم بر تعداد دانه کلزا 72

نمودار شماره 4-7- مقایسه میانگین اثر تراکم بوته بر تعداد غلاف در شاخه اصلی کلزا 74

نمودار شماره 4-8- مقایسه میانگین اثر سطوح کود آهن بر تعداد غلاف در شاخه اصلی 75

نمودار شماره 4-9- مقایسه میانگین اثر متقابل کود آهن و تراکم برتعداد غلاف در شاخه اصلی 75

نمودار شماره 4-10- مقایسه میانگین اثر تراکم بوته بر تعداد غلاف در شاخه فرعی 77

نمودار شماره 4-11- مقایسه میانگین اثر سطوح کود آهن بر تعداد غلاف در شاخه فرعی 77

نمودار شماره 4-12- مقایسه میانگین اثر متقابل کود آهن و تراکم بر غلاف در شاخه فرعی 78

نمودار شماره 4-13- مقایسه میانگین اثر تراکم بوته بر ارتفاع بوته 79

نمودار شماره 4-14-مقایسه میانگین اثر سطوح کود آهن بر ارتفاع بوته 80

نمودار شماره 4-15- مقایسه میانگین اثر متقابل سطوح کود آهن و تراکم بر ارتفاع بوته 80

نمودار شماره 4-16- مقایسه میانگین اثر تراکم بوته بر وزن هزار دانه 82

نمودار شماره 4-17- مقایسه میانگین اثر سطوح کود آهن بر وزن هزار دانه 82

نمودار شماره 4-18- مقایسه میانگین اثر متقابل سطوح کود آهن و تراکم بر وزن هزار دانه 83

نمودار شماره 4-19- مقایسه میانگین اثر تراکم بوته بر عملکرد دانه 84

نمودار شماره 4-20- مقایسه میانگین اثر سطوح کود آهن بر عملکرد دانه 85

نمودار شماره 4-21- مقایسه میانگین اثر متقابل سطوح کود آهن و تراکم بر عملکرد دانه 86

نمودار شماره 4-22- مقایسه میانگین اثر تراکم بوته بر درصد روغن 88

نمودار شماره 4-23- مقایسه میانگین اثر سطوح کود آهن بر درصد روغن در کلزا 89

نمودار شماره 4-24- مقایسه میانگین اثر متقابل سطوح کود آهن و تراکم بر درصد روغن 89

چکیده

بررسی اثر تراکم کاشت و سطوح مختلف کود آهن بر عملکرد و اجزای عملکرد کلزا رقم هایولا 401

به منظور بررسی اثر تراکم بوته و سطوح مختلف کود آهن برروی عملکرد و اجزای عملکرد کلزا رقم هایولا 401 در سال 1388 آزمایشی به صورت اسپلیت پلات در قالب طرح بلوک های کامل تصادفی با سه تکرار در منطقه ای واقع در 2 کیلومتری نورآباد ممسنی به اجرا درآمد که فاکتور های مورد بررسی عبارت بودند از: تراکم بوته در سه سطح ( 30 ، 50 و70 بوته در متر مربع ) به عنوان فاکتور اصلی در کرت های اصلی و سطوح مختلف کود آهن در سه سطح (1000×1)، (1000×2) و (1000×4) به عنوان فاکتور فرعی در کرت های فرعی.صفات مورد ارزیابی نیز شامل تعداد غلاف در بوته، تعداد دانه در بوته، تعداد غلاف در شاخه اصلی و فرعی، ارتفاع بوته، وزن هزار دانه، عملکرد روغن و درصد روغن در واحد سطح می باشد که نتایج حاصله از تجزیه آماری داده ها که به روش spss انجام گرفته شد نشان داد که هم اثر تراکم کاشت و هم اثر سطوح مختلف کود آهن بر روی کلیه صفات مورد بررسی در سطح احتمال 5% اختلاف معنی داری داشتند، که بیشترین عملکرد دانه در بین اثر متقابل تراکم کاشت و سطح کود آهن مربوط به تراکم 70 بوته در متر مربع و سطح کود آهن (1000 × 4) می باشد. به طور کلی بر اساس نتایج بدست آمده، کاشت کلزای هایولا 401 با تراکم 70 بوته در متر مربع و سطح کود آهن (1000× 4) برای کشت پائیزه در منطقه نورآباد ممسنی توصیه می شود.

واژه­های کلیدی: کلزا، هایولا 401، کود آهن، تراکم کاشت

مقدمه

سالها پیش نظریه پرداز بزرگ اروپایی مالتوس بیان نمود که در مقابل رشد تصاعد هندسی جمعیت رشد تولیدات کشاورزی روند تصاعد حسابی دارد و بروز قحطی و پیامدهای مرتبط با آن را برای بشریت پیش بینی نمود هرچند که امروزه به نظر می رسد که پیش بینی های او چندان دقیق نبوده است ولی نمی توان گرسنگی آشکار و پنهان در جوامع بشری را کتمان نمود و چنانچه نرخ رشد کنونی جمعیت بخصوص درکشورهای جهان سوم تعدیل نشد درآینده نزدیک شاهد فاجعه انسانی مرگ و میر گسترده دراثر گرسنگی خواهیم بود و میل به خودکفایی هدف نهایی برنامه ریزی های کشاورزی در سطح تمام کشورهای دنیا بخصوص کشورهای جهان سوم است (رستگار، م 1377).

خوشبختانه در طی یکی دو سال اخیر کشور عزیزمان ایران درامر تولید گندم به خود کفایی نایل گردیده است کاری بزرگ که دست آورد یک تلاش همگانی در کلیه سطوح و مجامع علمی و پژوهشی و اجرایی کشور می باشد ولی باید اذعان نمود که تا رسیدن به خود کفایی درکلیه محصولات کشاورزی کشور ما راه طولانی در پیش دارد و هم اکنون در محصولاتی مانند دانه های روغنی، شکر و ذرت نیاز گسترده ای به واردات می باشد (حقیقت نیا، رجایی 1387).

طبق گزارشهای موجود مصرف سرانه روغن خوراکی سالیانه برای هر نفر در ایران 16 کیلو گرم می باشد و با توجه به جمعیت کشور سالانه روغن خوراکی حدود یک میلیون تن برآورد می گردد و این در حالی است که تولیدات داخلی تنها 10% این نیاز را تامین می کند و افزون بر 90% روغن خوراکی کشور با صرف مبلغی بالغ بر 500 میلیون دلار از خارج وارد می گردد و برای کم کردن بار سنگین مالی واردات روغن خوراکی افزایش تولید داخلی در سالهای اخیر از طرف مسئولین امور کشاورزی توجه روز افزونی به کاشت و بهره برداری از گیاهان روغنی گردیده است که در زمینه باغبانی توسعه کاشت درخت زیتون و در زمینه زراعی افزایش سطح زیر کاشت زراعت کلزا مد نظر قرار گرفته است(حقیقت نیا، رجایی 1387).

با توجه به رشد حیرت انگیز علوم و توسعه فن آوری ها در همه زمینه های علوم کاربردی از جمله کشاورزی روز به روز شاهد افزایش تولید در واحد سطح هستیم و در رهگذر جهانی شدن و ایجاد دهکده جهانی و گسترش تبادلات تجاری و عضویت اکثر کشورها در سازمان جهانی تعرفه و تجارت ( گات ) بالطبع کشاورزانی موفق خواهند بود که بتوانند حداکثر تولید در واحد سطح را با حداقل هزینه به دست آورند.یکی از مهمترین عوامل در حصول به این نتیجه مصرف صحیح نهاده های کشاورزی از قبیل کود های شیمیایی می باشد، کودهای شیمیایی چه به لحاظ داشتن سهم عمده در افزایش تولید و چه از لحاظ هزینه ای که بر دوش کشاورزان جهت تهیه آنها می گذارد و چه به لحاظ رعایت مسائل زیست محیطی نقش بسیار مهمی در مطالعات زراعی و اقتصادی کشاورزی و همچنین بررسی و تلفیق مواد مطالعاتی دارد.

در طی سالهای اخیر توجه بسیار زیادی به توسعه کشت کلزا در جهت نیل به خود کفایی در امر تولید روغن خوراکی درکشور شده است و با توجه به نوپا بودن این زراعت در سطح جهانی و بخصوص در ایران کارهای تحقیقاتی فراوانی بر روی این گیاه انجام نگرفته است و از طرفی همه ساله ارقام جدید کلزا وارد کشور می شود که پتانسیل تولید این ارقام در مناطق مختلف معلوم نمی باشد و بخصوص بررسی عملکرد ارقام در شرایط خاص اقلیمی حائز اهمیت می باشد(حقیقت نیا، رجایی 1387).

اهداف تحقیق

1- تعیین بهترین سطح تراکم کاشت کلزا رقم هایولا 401 در منطقه نورآباد ممسنی

2- تعیین بهترین سطح کود آهن برای رشد و افزایش محصول و همچنین عملکرد و درصد روغن بالا در کلزا رقم هایولا 401 در منطقه نورآباد ممسنی

3- ارائه ی راهکارهایی برای افزایش عملکرد کمی و کیفی کلزا رقم هایولا 401 در منطقه نورآباد ممسنی

4- مشخص کردن پتانسیل تولید کلزا رقم هایولا 401 در منطقه نورآباد ممسنی

5- مقایسه اثر متقابل تراکم کاشت و سطوح مختلف کود آهن بر عملکرد و اجزای عملکرد کلزا رقم هایولا 401 در منطقه نورآباد ممسنی

فصل اول

کلیات

1– کلیات

1– 1 تراکم کاشت

با توجه به افزایش جمعیت جهان در سالهای اخیر و نیاز روز افزون جوامع بشری به ویژه کشور ما و فراورده های دانه های روغنی، کشت دانه های روغنی و مدیریت صحیح در افزایش عملکرد، از اهمیت زیادی برخوردار است ( امام و ایلکایی، 1381 ). در این میان کلزا به عنوان یکی از مهمترین گیاهان روغنی در سطح جهان مطرح می باشد و اخیرا کشت و کار آن در کشور افزایش قابل توجهی داشته است.

تراکم مطلوب بوته و آرایش کاشت بهینه از مهمترین فاکتور های به زراعی جهت رسیدن به حداکثر عملکرد در محصولات زراعی است. با اتخاذ چنین روشهایی در کنار استفاده از ارقام مناسب و سازگار با شرایط اقلیمی هر منطقه و نیز حد اکثر استفاده از منابع محیطی نظیرنور، آب و مواد غذایی می توان به عملکرد بیشتری دست یافت ( پزشک پور و همکاران ، 1379 ).

میزان بذر و فاصله خطوط به عنوان فاکتور اصلی تراکم بوته در واحد سطح نقش به سزایی در عملکرد نهایی خواهند داشت. طبق گزارشهای ارائه شده توسط برخی پژوهشگران، افزایش تراکم بوته از طریق کاهش تعداد شاخه های فرعی، تعداد غلاف در بوته، تعداد دانه در بوته و وزن هزار دانه در هر بوته، باعث کاهش عملکرد دانه در تک بوته می شود، اما افزایش مطلوب تراکم منجر به جبران کاهش شاخه های فرعی و اجزای عملکرد در گیاه از طریق افزایش تعداد بوته خواهد شد.

تحقیقات انجام شده نشان می دهد که با افزایش تراکم بوته ( بیش از تراکم مطلوب )، وزن خشک دانه در تک بوته روندی کاهشی دارد، زیرا افزایش تراکم باعث بسته شده کانوپی می شود، رقابت بین بوته ای زیاد شده و مواد غذایی قابل استفاده و توانایی گیاه جهت استفاده از شرایط محیطی ازجمله نور برای انجام فتوسنتز کاهش می یابد. در نتیجه گیاه با یک نوع تنش مواجه می شود و برای کاهش اثرات آن و ایجاد موازنه در فتوسنتز، تنفس و ذخیره مواد، بر سرعت پر شدن دانه می افزاید که این امر موجب کاهش تعداد دانه در غلاف، کوتاه شدن مدت زمان پر شدن دانه ها و در نتیجه کاهش وزن هزار دانه می گردد (امام، ی وایلکائی 1381).

بیل جیلی و همکاران ( 2003 ) اعلام نمودند که ارقام مختلف در تراکم های کمتر عملکرد کمتری داشته اند ولی در تراکم های بیشتر علاوه بر عملکرد بالا در کاهش میزان علفهای هرز نیز موثر می باشند.

1 – 2 عنصر های غذایی

کربن، هیدروژن، اکسیژن، نیتروژن، فسفر و گوگرد عناصری هستند که پروتئین ها و در نتیجه پروتوپلاسم از آنها ساخته می شوند, علاوه بر این شش عنصر چهارده عنصر دیگر هم هستند که برای رشد بعضی از گیاهان ضروری هستند: کلسیم، منیزیم، پتاسیم، آهن، منگنز، مولیبدن ، مس، بور، روی ، کلر، سدیم، کبالت ، وانادیم و سیلیسیم.

بطور خلاصه بدین صورت می توان این مواد غذایی را تعریف و تقسیم نمود؛

16 عنصر با توجه به منبع تامین:

از منبع هواو آب: C –H –O

از منبع خاک: الف ) عناصر غذایی پر مصرف ( عناصری که گیاه به مقدار زیاد به آنها نیاز دارد ) مانند:

N – P –K – Ca –Mg – S

ب ) عناصر غذایی کم مصرف ( عناصری که گیاه به مقدار کمتری به آنها نیاز دارد ) مانند:

Zn – Cu – Fe – Mo – Cl – Bo – Mn

چهار عنصری که در بعضی از مواقع باعث رشد بهتر گیاه می شوند:

Na – Va – Si – Co

که مابقی 72 عنصر دیگر غیر اساسی محسوب شده و بعضی از عناصر مثل:

Pb – Hg – Al – Cd

سمی می باشند.

1-2– 1 : تقسیم بندی عناصر غذایی

الف ) عناصر غذایی اساسی: آنهایی هستند که حتی اگر یکی از آنها در دسترس گیاه نباشند رشد رویشی و یا زایشی گیاه کامل نمی شود.

ب ) عناصر غذایی مفید و گاهی لازم: آنهایی هستند که عدم وجودشان در خاک رشد گیاه را ناقص نمی کند اما وجودشان در خاک سبب بهبود رشد گیاه می شوند.

ج ) عناصر غذایی غیر اساسی: آنهایی هستند که وجودشان تاثیری بر رشد گیاه ندارد.

1-2-2 : رابطه درجه فراهمی عناصر با (pH) :

در خاکهایی که درجه اسیدیته بالایی داشته باشند، درجه فراهمی نیتروژن توسط با کتری­ها نیترات سازی خوبی از خود نشان می دهند که این درجه فراهمی در مورد پتاسیم ، گوگرد ، کلسیم ، منیزیم و مولیبدن نیز صادق است . اما هرچه خاک قلیایی تر شود در اختیار گرفتن درجه فراهمی نیتروژن با مشکل مواجه می شود که در میان عناصر کم مصرف نظیر: آهن، منگنز، روی ، مس و بور به همین منوال می باشد.

1-3 عنصر آهن

1-3-1 نقش آهن در زندگی گیاه

آهن در مقداری از دیاستازهای گیاهی نقش موثری ایفا می کند. تشکیل و فعالیت دیاستازهایی مانند پروکسی دازها و سیتوکورومها تحت تاثیر مقدار آهن می باشند. آهن یکی از عوامل موثر تشکیل کلروفیل محسوب می شود، به همین علت است که تشکیل کلروفیل گیاهانی که در معرض کمبود آهن قرار دارند به سختی انجام می شود.

آهن به صورت Fe²⁺ توسط گیاه جذب می گردد، وظایف اصلی آهن را می توان در بدن جانوران و گیاهان به صورت زیر خلاصه نمود :

• جزء ساختمان مولکولهای پورفیبرین ، سیتو کرومها وهماتین و .... می باشد.
• این ترکیبات در واکنشهای اکسیداسیون ، احیا ، تنفس و فتو سنتز لازم هستند.
• جزء ساختمان مولکولهای غیر هم مثل فرواکسین می باشند.
• نقش در سیستم آنزیمی همانند آنزیمهای سیتوکروم، اکسیداز، کاتالاز ، اکوتیناز و .....Tisdale), و همکاران 1990).

1-3-2 : منابع کودهای محتوی آهن:

در حال حاضر می توان در کودهای سولفات آهن موجود در بازار که دارای 24% تا 20% آهن می باشند به صورت محلول پاشی در مزارع و یا چال کود در باغها استفاده کرد که در نباتات زراعی هنگام تهیه بستر بذر یا سایرکودهای اصلی قابل مصرف می باشند.

مصرف کودهای آهن کلات دار با بنیان EDDHA نظیر سکوسترون آهن 138 مقرون به صرفه است ، این کودها حاوی 6% آهن کلاته بوده و همراه با آب آبیاری استفاده می شود.

در محیطهای آهکی – قلیایی از محلول های متعدد دیگری استفاده می شود که در بین آنها می توان موارد زیر را نام برد:

1- اسید آمینو پولی کاربوکلسیک آهن یا APCA- Fe

2- DTPA ( اسید استیک در اتیلین تری آمین پنتا )

3- E.D.D.H.A - Acid etyhlenediamine di – ohydroxy ohena cetique

تحرک و تاثیر این موارد از نظر اهمیت قابلیت جذب آهن در pH=7 به ترتیب افزایش اهمیت به قرار زیر است:

APCA > DTPA > HEEDTA > ECTA

1-3-3 : علائم کمبود آهن:

علائم کمبود بیشتر در بافت جوان ظاهر می گردد، در مراحل اولیه با رنگ پریدگی شروع میشود و رگبرگ ها باقی می ماند با ادامه کمبود تمام برگ تحت تاثیر کمبود آن قرار می گیرند سپس رنگ برگ سفید شده و علائم سوختگی یا قهوه ای شدن به صورت لکه هایی درسراسر برگها ظاهر می گردد.