چکیده:

 

وجود رنگدانه­های آنتوسیانین در برنج عامل اصلی تولید پایه ساقه ارغوانی رنگ محـسوب می­شود. رنگ پایه ساقه در برنج رابطه مستقیم و قوی با تشکیل دانه­های رنگی در برنج دارد که در زیر پوسته آنها به دلیل تراکم متفاوت رنگیزه­های آنتوسیانین در لایه­های مختلف پریکارپ، پوشش دانه و آلورون، رنگ­های سرخ، ارغوانی و سیاه مشاهده می­شود. بمنظور درک درست از مسیر بیوسنتزی آنتوسیانین که اطلاعات مفیدی را در زمینه بیولوژی مولکولی و ژنتیک برنج به همراه خواهد داشت، الگوی تفرق ژن رنگ پایه ساقه با استفاده از تعداد 123 تک بوته از جمعیتF₂حاصل از تلاقی 18-33 - DNو ندا مورد مطالعه قرار گرفت. ارزیابی تک بوته­های F₂بر اساس رنگ پایه ساقه نشان داد تعداد 83 بوته رنگی (ارغوانی) و تعداد 40 بوته بی­رنگ تولید شده نسبت تفرق 1 :075/2 را ایجاد می­نماید. آماره c² این نسبت تفرق برابر 48/3 بود که از نسبت تفکیک 3:1 اختلاف معنی داری را نشان نداد (95/0p < ). در نتیجه ثابت شد که صفت مورد نظر از سیستم کنترل تک ژنی تبعیت می­نماید. مطالعات انجام شده با استفاده از 59 نشانگر مولکولی میکروساتلیت میزان 28 درصد چند شکلی بین والدین را نشان داد و آنالیز پیوستگی روی تک بوته­های مغلوب جمعیت F₂ از تلاقی ندا × 18-33 - DNثابت کرد که ژن رنگ پایه ساقه بر روی بازوی کوتاه کروموزوم شماره 6 برنج با نشانگرRM253 که در فاصله 15 سانتی مورگان از ژن قرار دارد همبسته مي باشد.

 

واژه­های كليدي:

برنج، رنگ ساقه، نشانگر­های SSR.

 

 

فهرست مطالب

عنوان صفحه

فصل اول

مقدمه

1-1- تولیدکنندگانبرنج2

1-2- کشتبرنجدرایران2

1-3- متابولیت­هایثانویهدرگیاهان3

1-4- تهیه نقشه­های ژنتیک4

 

فصلدوم

کلیاتومرورمنابع

2-1- مشخصاتگیاهشناسیبرنج7

2-2- وضعیتژنتیکیبرنج7

2-3- مهندسیتولیدمتابولیت­هایثانویهدرگیاهان8

2-4- ژن­هایمسئولبیوسنتزفلاوونوئیدهاوآنتوسیانین­ها9

2-5- برنجرنگی11

2-6- نشانگرهادربرنامه­هایاصلاحی12

2-6-1- تعریفنشانگر12

2-6-2- انواعنشانگرها13

2-6-2-1- نشانگرهایموفولوژیکی13

2-6-2-2- نشانگرهایسیتوژنتیکی13

2-6-2-3- نشانگرهایبیوشیمیایی14

2-6-2-4- نشانگرهایمولکولی14

2-6-2-4-1- نشانگرهایمولکولیمبتنیبرDNA 15

2-6-2-4-1-1- نشانگر­هایمولکولیمبتنیبرهیبریداسیون15

2-6-2-4-1-2- نشانگر­های مولکولی مبتنی بر واکنش زنجیره­ای پلیمراز16

2-6-2-4-1-3- نشانگرهای مولکولی مبتنی بر PCR و هیبریداسیون16

2-6-2-4-1-4- نشانگرهای مبتنی بر توالی­یابی (SNPها) و تراشه DNA17

2-7- کاربردنشانگرهایمولکولی17

2-8- انتخابمیانانواعمختلفنشانگرها19

2-9- کاربردنشانگرهایمولکولیدربرنج19

2-10- انتخاببهکمکنشانگرها21

2-11- استفادهازنشانگرهایمولکولیدرتهیهنقشهژنتیکی21

2- 12- ریزماهواره22

2-12-1- تشخیصآلل­هایریزماهواره24

2-12-2- مزایاینشانگرهایریزماهواره24

2-12-3- مشکلات کار با ریزماهواره25

2-12-3-1- اشتباهات آلل خوانی25

2-12-3-2- آلل­های صفر26

2-12-3-3- اندازهنمونهموردنیاز26

2-12-4- ریزماهواره­هادرگیاهانوبرنج27

2-12-5- کاربردهایریزماهواره28

2-13- نقشه­هایپیوستگیژنتیکی28

2-14- ویژگی­هاینقشه29

2-15- سابقهنقشهیابیصفترنگدربرنج30

2-15-1- ارتباط بین رنگ پریکارپ وصفت گلوتیوز33

2-15-2- توارث رنگ نوک دانه و ارتباط آن با صفات دیگر33

2-15-3- روابط بین رنگ کلالهبا صفات دیگر34

2-15-4- ارتباطات بین رنگ پوشبرگ و صفات دیگر34

2-15-5- ارتباط بین رنگ کلاله و رنگ پوشبرگ35

2-15-6- ارتباط بین رنگ زبانک با صفات دیگر35

2-15-7- ارتباطات بین رنگ زبانک و رنگ پریکارپ35

2-15-8- نشاندار کردن ژن­های مهم اقتصادی و انتخاب به کمک نشانگر (همراه)36

2-15-9- مطالعه ژنتیکی و نشاندارکردن ژن صفت رنگ در برنج37

فصل سوم

مواد و روشها

3-1- مواد گیاهی41

3-1-1- رقم 18-33DN-41

3-1- 2- رقم ندا42

3-2- کشت والدین و جمعیت F₂43

3-3- تهیه نمونه برگی43

3-4- ارزیابی صفت44

3-5- استخراج DNA44

3-5-1- روش استخراج DNA45

3-6- بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده49

3-6-1- ازطریق اسپکتروفتومتر49

3-6-2- به وسیله الکتروفورز ژل آگارز49

3-7- بارگذاری نمونه­ها و اجرای الکتروفورز50

3-8- آماده سازی آغازگرهای ریزماهواره51

3-9- انجامواکنش PCR53

3-10- تجزیه وتحلیل داده ها54

 

فصل چهارم

نتایج و بحث

4-1- ارزیابی فنوتیپی57

4-2- ارزیابی مولکولی58

4-2-1- غربال والدین58

4-2-2- تحلیل لینکاژ60

4-3-ارزیابی نشانگر RM253 در ارقام دیگر برنج64

 

فصل پنجم

پیشنهادات68

 

منابع70

 

ضمائم

لیست پرایمرهای بکار رفته در پژوهش79

تهیه محلول­های مادری81

ماتریس داده­های مولکولی و فنوتیپی83

 

چکیده انگلیسی

 

فهرست شکل­ها

عنوان صفحه

شکل 3-1. لاین 18-13-DN.. 41

شکل 3-2. والد 18-13-DN باپایه ساقه سبز رنگ.. 42

شکل 3-3. لاین ندا.. 42

شکل 3-4. والد ندا با پایه ساقه ارغوانی رنگ.. 43

شکل3-5. عملیات نمونه برداری از نمونه­های برگی برنج دو هفته پس از نشاء 44

شکل 3-6. پودر کردن نمونه­های برگی با استفاده از ازت مایع.. 46

شکل 3-7. سانتریفیوژ کردن نمونه­ها.. 47

شکل 3-8. تشکیل سه فاز مشخص پس از افزودن کلروفرم و جدا نمودن فاز رویی 47

شکل 3-9. تشکیل کلاف DNA پس از مصرف ایزوپروپانول.. 48

شکل 3-10. افزودن TE به رسوب DNA و نگهداری آنها در فریزر 20-.. 48

شکل 3-11 . بارگذاری نمونه ها در ژل آگارز.. 51

شکل3-12 . نمونه هایی ازDNA ژنومی که به روشCTAB استخراج شده است... 52

شکل3-13. عملیات انجام PCR.. 54

شکل 4-1. الگوی نواربندی بین والدین مورد مطالعه با تعدادی از نشانگرهایSSR مورد مطالعه.. 60

شکل 4-2. الگوی نوار بندی بین والدین مورد مطالعه با تعدادی از نشانگرهای SSR مورد مطالعه.. 60

شکل 4-3. الگوی نواربندی بین والدین مورد مطالعه در 10 گیاه دارای پایه ساقه سبز با استفاده از نشانگرRM1358.. 61

شکل4-4. الگوی نواربندی بیـن والدین مورد مطالعـه در گیاهان دارای پایـه ساقه سـبز و ارغوانـی بـا استفاده ازنشانگر RM443.. 62

شکل 4-5. الگوی نواربندی بین والدین مورد مطالعه با 10 گیاه با پایه ساقه سبز با استفاده از نشانگر RM253.. 62

شکل4-6. نحوه تعیین ژنوتیپ تعدادی از محصولات واکنـش زنجیره­ای پلیمراز نشـانگر RM253 در جمعیـتی از بوته­های F2 بر روی ژل آگارز.. 63

شکل 4-7 .آنالیز ارقام دارای پایه­های ارغوانی و سبز با پرایمر RM253.. 65

شکل 4-8. نقشه ژنتیکی نشانگر RM253 روی بازوی کوتاه کروموزوم 6.. 66

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول2-1. لیست ژن­های نشاندار شده توسط مارکرهای مولکولی در برنج.. 38

جدول3-1. درجه حرارت و زمان بهینه شده در مراحل مختلف واکنش PCR.. 54

جدول3-2. مقادیر بهینه شده مواد واکنش زنجیره ای پلیمراز.. 55

جدول 4-1. آماره محاسباتی c2 با درجه آزادی 1 برای صفت رنگ پایه ساقه در جمعیت F2.. 57

جدول 4-2. نشانگرهای پلی­مورف به کار رفته در این تحقیق.. 59

جدول 4-3. آزمـون2c بـرای مقایـسـه فـراوانی­های ژنوتیپی نشـانگر RM253 با فراوانی­های مورد انتظار 1:2:1 در جمعـیت F2.. 63

 

فصل اول

مقدمه

 

1-1- تولید کنندگان برنج

برنج پس از گندم دومین غله مهم در دنیا به حسـاب می­آید و به عنوان یکی از مهمترین محصولات استراتژیک جهان از اهمیت و جایگاه ویژه­ای برخوردار است، نزدیک به 90 درصد سطح زیر کشت و تولید برنج متعلق به کشورهای خاور دور می­باشد. بیش از نصف محصول برنج دنیا در دو کشور هند و چین تولید می­شود. به طور کلی، کشورهای گرمسیری و نیمه گرمسیری برمه، تایلند، ویتنام، لائوس، اندونزی، فیلیپین، پاکستان، هند، آمریکا، ژاپن، ایتالیا، مصر، چین، برزیل، کوبا، مکزیک و استرالیا از تولیدکنندگان عمده برنج به شمار می­آیند. میزان تولید برنج در تایلند، برمه، ویتنام و لائوس بیش از مصرف داخلی آنهاست و بنابراین نزدیک به 90 درصد برنج موجود در بازارهای دنیا متعلق به این 4 کشور می­باشد (53).

1-2- کشت برنج در ایران

کشت برنج در ایران در نواحی شمالی و در نواحی جنوبی به ویژه خوزستان تاریخچه طولانی دارد. شواهد نشان می­دهد که این محصول در این ناحیه، قرنها پیش از میلاد مسیح و در زمان هخامنشیان رواج داشته است. در ایران اسلامی نیز علی رغم دستاوردهای خوب تحقیقاتی و قریب به 600 هکتار زیر کشت برنج، متاسفانه به دلیل استفاده ناصحیح و توسعه محدود ارقام اصلاح شده و با توجه به رشد روز افزون جمعیت ایران، تولید داخلی برنج پاسخگوی نیاز مردم نیست و مقادیر قابل توجهی از خارج وارد می­شود. افزایش تولید به دو روش افزیش سطح زیر کشـت و افزایش در واحد سطـح امـکان­پذیر می­باشد. بدلیل محدود بودن زمین­های زراعی و نیز کمبود شدید آب، بدون تردید باید تولید را در واحد سطح با استفاده از روش­های به­زراعی و به­نژادی افزایش داد. دستیابی به خودکفایی در تولید برنج و حفظ ثبات قیمت آن، از جمله اهداف مهم در کشورهای کم درآمدی است که برنج بعنوان تنها غذای اصلی، اساس تأمین نیازهای غذایی بوده و برای مردم فقیر و آسیب پذیر این کشورها شغل و درآمد ایجاد می­نماید(53).

1-3- متابولیت­های ثانویه در گیاهان

بعضی از موجودات زنده خصوصاً گیاهان، طیف وسیعی از ترکیبات موسوم به متابولیت­های ثانویه را تولید می­کند. در مفهوم کلی، متابولیت­های ثانویه ترکیبات آلی هستند که نقش ضروری در رشد و نمو موجود زنده ندارند. با مطالعاتی که تا کنون صورت گرفته است، به نظر می­رسد که متابولیت­های ثانویه به عنوان مواد طبیعی نقش اکولوژیکی مهمی در واکنش­های دفاعی گیاهان و همچنین گرده افشانی و انتشار دانه­های گیاهان به وسیله حشرات و حیوانات دارند. بعضی از این ترکیبات به عنوان علف­کش و حشره کش در صنعت استفاده می­شوند در حالی که برخی دیگر کاربرد صنعتی ندارند. دسته بزرگی از متابولیت های ثانویه کاربرد دارویی و پزشکی دارند. ترکیبات دیگری از این گروه نیز نقش مهمی در تغذیه انسان و دام و كیفیت مواد غذایی (رنگ، طعم و بو) مختلف دارند (72).

به دلیل كاربردهای فراوان، متابولیت­های ثانویه موضوع جالبی برای تحقیقات اصلاح نباتات از طریق روش­های مولكولی و مهندسی ژنتیـك محسـوب می­شوند. مطالعه در زمینه وظایف این تركیبات در گیاهان، یك موضوع جالب و مهم برای بسیاری از پروژه­های تحقیقاتی شده است و نقش تعدادی از این تركیبات مورد بررسی و تحقیق قرار گرفته است.

در ده سال گذشته تحقیقات چندانی در ارتباط با متابولیت­های ثانویه انجام نشده است. مانع بزرگ در انجام این تحقیقات اطلاعات اندك از مسیرهای تولید زیستی متابولیت­های ثانویه و برهم كنش آنزیم­های درگیر در این مسیر همچنین اطلاعات محدودی از ژن­های مربوط به متابولیت­های ثانویه در دسترس است. یكی از مسیرهایی كه مطالعات بیشتری در سطح ژن­های دست اندركار آن نسبت به دیگر متابولیت­های ثانویه انجام شده است، مسیـر تولید فلاوونوئیدها و آنتوسیـانین­ها است (20). اكثـر ژن­های درگیر در مسیر تولید آنتوسیانین­ها همسانه­سازی شده و مطالعات فراوانی در سطح بیوشیمیایی، مولكولی و ژنتیك این دست از متابولیت­های ثانویه صورت گرفته است. یكی از مهمترین دلایل مطالعات بیشتر در این زمینه، آسانی بررسی این مواد از روی رنگ گل­ها، نوک دانه و پایه ساقه در گیاهانی همچون برنج است که بر اساس فنوتیپ قابل ارزیابی است (73). هدف از مهندسی ژنتیك مسیر یك متابولیت ثانویه، افزایش مقدار یك ماده خاص یا گروهی از تركیبات و یا حتی كاهش مقدار این تركیبات است. برای دستیابی به هدف دوم كه كاهش میزان تولید یك ماده خاص یا گروهی از مواد ناخواسته است، راه­های مختلفی وجود دارد. این مواد ممكن است تركیبات سمی در یك محصول گیاهی، مواد مانع خالص سازی یك فرآورده صنعتی یا موادی از این دست باشد. یكی از این راه­ها، مسدود كردن یك مرحله از مسیر تولید متابولیت ثانویه و مختل كردن تولید یا فعالیت آنزیم مربوط به آن مرحله است. این هدف می­تواند با كاهش میزان mRNA مسئول تولید این آنزیم، با استفاده از فناوری آنتی­سنس، RNAi یا بیان بالای یك آنتی­بادی علیه آنزیم مسئول محقق شود. فناوری آنتی­سنس برای تغییر رنگ به طور گسترده­ای استفاده شده است. راه­های دیگر دستیابی به این هدف، تغییر مسیر به سوی مسیرهای موازی یا افزایش كاتابولیسم محصول نهایی است. اما ممكن است هدف از انجام تحقیقات، افزایش تولید یك تركیب خاص در گیاه بوده یا انتقال ژن­های مربوط به مسیر تولید یك متابولیت ثانویه به یك گیاه یا یك ریزسازواره مورد نظر باشد. همچنین ممكن است تولید یك ماده جدید كه به صورت طبیعی در گیاهان تولید نشود هدف یك پروژه تولیدی- پژوهشی باشد. در بـرخی روش­ها با تغییر میزان بیان یك یا چند ژن، بر موانع تولید یك ماده غلبه می كنند و در روش های دیگر، با حذف مسیرهای موازی (رقابتی) یا كاهش كاتابولیسم ماده مورد نظر، مقدار آن ماده را در گیاه می­افزایند. ایجاد تغییراتی در بیان ژن­های تنظیمی كه كنترل مسیر تولید زیستی متابولیت­های ثانویه را برعهده دارند نیز از جمله روش­های افزایش یا كاهش تولید تركیب مورد نظر است.

1-4- تهیه نقشه­های ژنتیک

ریشه بسیاری از محدودیت­های روش­های مختلف اصلاح نباتات، نبود زیر بنا و مقدمات ضروری اساسی برای مطالعات ژنتیک است. یکی از اجزای کلیدی و زیر بنایی و ابزار اساسی مورد نیاز برنامه-های آینده اصلاح نباتات، تهیه نقشه­های ژنتیک است. شاید یکی از مهم­ترین کاربرد نشانگرهای DNA تهیه نقشه-های ژنتیک باشد که براساس آن می­توان جایگاه ژنی و کروموزومی ژن­های تعیین کننده صفات مطلوب (ترتیب و فاصله ژن­ها و نشانگرها از یکدیگر بر روی کروموزوم ها) را تعیین کرد.

با دانستن جایگاه یک ژن روی نقشه ژنتیک، می­توان از نشانگرهای مجاور آن برای احراز جود یک صفت متناظر استفاده کرد. بدین ترتیب نیازی به انتظار برای ظهور آثار ژن نیست. با استفاده از نشانگرهای DNA می توان صفات و مشخصات آینده یک نشای برنج را پیش بینی کرد. در نتیجه تاثیری مثبتی بر اصلاح و پیشبرد گیاه دارد.

هدف از این پژوهش، مطالعه ژن کنترل کننده رنگ پایه ساقه در ژنوم برنج و شناسایی جایگاه­ ژنومی آن از طریق مارکرهای همبسته و ارزیابی نشانگرهای مولکولی ریزماهواره در شناسایی ارقام دارای ژن کنترل کننده رنگ پایه ساقه می­باشد. این مطالعه پیش نیاز مطالعات مولکولی بوده و مواد اصلاحی با ارزشی را برای آنها از طريق شناسایی نشانگرهای مولکولی همبسته با ژن فراهم می­آورد.