کلیات تحقیق.. 2

1-1 گیاه­شناسی پپرومیا. 2

1-2 نگهداری گیاه پپرومیا. 2

1-3 نقش کشت بافت در تکثیر گیاهان. 3

1-4 ترکیبات محیط­های کشت. 5

1– 4 – 1 مواد غیر آلی. 6

1– 4– 2 منبع کربن. 6

1 – 4 – 3 ویتامین­ها. 6

1 – 4 – 4 آمینواسیدها و مکمل­های آلی. 7

1 – 4- 5 تنظیم کننده­های رشد گیاهی. 7

1 – 4 - 6 عامل ژله­ای­کننده. 7

1– 4 – 6 – 1 آگار. 7

1-5 ظروف کشت. 8

1 – 6 انتخاب و تهیه ریزنمونه. 8

1 – 7 ریزازدیادی. 8

1-8 کودهای زیستی. 9

1-9 باکتری­های محرک رشد گیاه (PGPRها). 9

1-10 مکانیسم عمل PGPRها. 11

1-10-1 نقش مستقيم PGPRها. 12

1-10-2 نقش غيرمستقيم PGPRها. 13

1-11 اهداف تحقیق. 13

فصل دوم: مروری بر تحقيقات انجام شده. 15

2– 1 سوابق استفاده از PGPRدر کشت بافت سایر گیاهان. 15

2– 2 سوابق استفاده از PGPRدر کشاورزی. 15

فصل سوم: مواد و روشها22

3 – 1 محل انجام آزمایش. 22

3 – 2 تهیه گیاه مادری. 22

3-3 تهیه و واکشت سویه­های باکتریایی. 22

3-4 ترکیبات و ساخت محیط کشت. 23

3-5 ضدعفونی ریزنمونه­های گیاهی پپرومیا. 24

3-6 شرایط کشت ریزنمونه­ها. 26

3-7 کشت اولیه. 26

3-8 آزمایش بررسی اثر استفاده از تیمارهای مختلف گندزدایی در جلوگیری از آلودگی در کشت بافت گیاه پپرومیا. 26

3-9 بررسی تاثیر افزایش غلظت فسفر بر اندام­زایی پپرومیا. 27

3-10 اثر سطوح مختلف ساکارز بر اندام­زایی پپرومیا. 28

3-11 تاثیر سطوح هورمونی و تلقیح با باکتری بر رشد ریزنمونه جوانه جانبی درون شیشه. 28

3- 12 تاثیر تلقیح با باکتری بر سازگاری گیاهان تکامل یافته در گلدان. 29

3-13 صفات اندازه­گيري شده. 30

3-13-1 میانگین تعداد برگ در هر بوته. 30

3-13- 2 ارتفاع ساقه. 30

3-13-3 تعداد ریشه در هر بوته. 30

3-13-4 طول کل ریشه. 30

3-13-5 تعداد جوانه جانبي. 30

3-13-6 توسعه برگي. 30

3-13-7 وزن تر بوته. 31

3-13-8 وزن خشک بوته. 31

3-14 تجزیه آماری. 31

فصل چهارم: نتايج و بحث.. 32

4-1 مقدمه. 32

4-2 بررسی اثر استفاده از تیمارهای مختلف گندزدایی در جلوگیری از آلودگی در کشت بافت گیاه پپرومیا. 32

4– 3 بررسی تاثیر افزایش غلظت فسفر بر اندام­زایی پپرومیا. 33

4-4 اثر سطوح مختلف ساکارز بر اندام­زایی پپرومیا. 34

4-5 تاثیر سطوح هورمونی و تلقیح با باکتری بر رشد ریزنمونه جوانه جانبی درون شیشه (2 هفته بعد از كشت). 34

4-5-1 تعداد برگ. 35

4-5-2 طول ساقه باززا شده. 36

4-5-3 تعداد ريشه باززا شده. 37

4-5-4 کل طول ریشه باززا شده. 37

4-5-5 ميانگين طول ریشه. 38

4-5-6 تعداد جوانه رشد كرده. 39

4-5-7 توسعه برگي. 39

4-6 تاثیر سطوح هورمونی و تلقیح با باکتری بر رشد ریزنمونه جوانه جانبی درون شیشه (چهار هفته بعد از كشت). 41

4-6-1 تعداد برگ. 41

4-6-2 طول ساقه. 42

4-6-3 تعداد ريشه. 43

4-6-4 کل طول ریشه باززا شده. 44

4-6-5 ميانگين طول ریشه. 46

4-6-6 تعداد جوانه رشد كرده. 47

4-6-7 توسعه برگي. 47

4-7 تاثیر سطوح هورمونی و تلقیح با باکتری بر رشد گیاهچه­های کشت بافتی پپرومیا در مرحله سازگاری. 47

4-7-1 تعداد برگ. 48

4-7-2 طول ساقه. 49

4-7-3 تعداد ريشه. 49

4-7-4 کل طول ریشه. 49

4-7-5 ميانگين طول ریشه. 50

4-7-6 توسعه برگي. 50

4-7-7 وزن تر بوته. 51

4-7-8 وزن خشک بوته. 52

4-8 اندام­زایی مستقیم در گیاه پپرومیا. 53

فصل پنجم: نتيجه گيری.. 54

5-1 بحث. 54

5-2 نتایج. 56

5-3 پیشنهادات. 57

منابع.. 58

 

فهرست جداول:

 

عنوان صفحه

 

جدول 3-1 مقادیر قند به کار رفته در محیط کشت .............................................................................................. 30

جدول 4-1 نتایج تجزیه واریانس اثر تیمارهای مختلف ضدعفونی در جلوگیری از آلودگی ریزنمونه در کشت بافت پپرومیا..................................................................................................................................................................... 35

جدول 4-2 خلاصه تجزیه واریانس اثر سطوح مختلف هورمون و باکتری بر صفات مربوط به رشد درون شیشه ای ریزنمونه جوانه جانبی پپرومیا ................................................................................................................................38

جدول 4-3 خلاصه تجزیه واریانس اثر سطوح مختلف هورمون و باکتری بر صفات مربوط به رشد درون شیشه ای ریزنمونه جوانه جانبی گیاه پپرومیا ­(تاریخ دوم)......................................................................................................44

جدول 4-4 خلاصه تجزیه واریانس سطوح مختلف هورمون و باکتری بر صفات مربوط به رشد گیاهچه­های کشت بافتی پپرومیا در مرحله سازگاری......................................................................................................................................51

فهرست نمودار­ها:

عنوان نمودار صفحه نمودار4-1 درصد بروز آلودگی ریزنمونه تحت تیمارهای مختلف ضدعفونی در کشت بافت گیاه پپرومیا .... 36 نمودار 4-2 اثر تیمار باکتری بر تعداد برگ گیاه پپروميا درون شیشه............................................................... 39 نمودار 4-3 اثر تیمار باکتری بر طول ساقه باززا شده گیاه پپروميا ................................................................... 40 نمودار 4-4 اثرمتقابل سطوح هورمون و باکتری بر كل طول ریشه در گیاه پپروميا درون ............................... 41 نمودار 4-5 اثرمتقابل سطوح هورمون و باکتری بر ميانگين طول ریشه در گیاه پپروميا درون شیشه............... 42 نمودار 4-6 اثرمتقابل سطوح هورمون و باکتری بر تعداد برگ گیاه پپروميا درون شیشه (تاريخ دوم).............. 45 نمودار 4-7 اثر سطوح هورمون بر طول ساقه باززا شده گیاه پپروميا (تاريخ دوم) .......................................... 46 نمودار 4- 8 اثر سطوح هورمون بر تعداد ريشه باززا شده گیاه پپروميا (تاريخ دوم)....................................... 47 نمودار 4-9 اثر تيمار باكتري بر تعداد ريشه باززا شده گیاه پپروميا (تاريخ .......................................................47 نمودار 4- 10 اثر سطوح هورمون بر كل طول ريشه باززا شده گیاه پپروميا (تاريخ ....................................... 48 نمودار 4- 11 اثر تيمار باكتري بر كل طول ريشه باززا شده گیاه پپروميا (تاريخ دوم)...................................... 49 نمودار 4- 12 اثر سطوح هورمون بر ميانگين طول ريشه باززا شده گیاه پپروميا (تاريخ دوم).......................... 50 نمودار 4- 13 اثرمتقابل سطوح هورمون و باکتری بر تعداد برگ گیاه پپروميا در مرحله سازگاري .................. 52 نمودار 4 -14 اثر سطوح هورمون بر طول كل ريشه گیاه پپروميا در مرحله سازگاري...................................... 53 نمودار 4- 15 اثرمتقابل سطوح هورمون و باکتری بر توسعه برگ گیاه پپروميا در مرحله سازگاري ................ 54 نمودار 4- 16 اثر تیمار باکتری بر وزن تر گیاه پپروميا در مرحله سازگاري...................................................... 55 نمودار 4- 17 اثرمتقابل سطوح هورمون و باکتری بر وزن خشك گياه پپروميا در مرحله سازگاري ................ 56

 

فهرست شکل­ها­:

 

عنوان شکل صفحه   شکل 1-1 گیاه پپرومیا (برگ قاشقی) .................................................................................................. 5 شکل 3-1 قرار دادن باکتری­ها بر روی شیکر جهت تهیه مایع تلقیح ................................................. 25 شکل 3-2 ساخت محیط کشت و تنظیم pH محیط کشت ............................................................... 26 شکل 3-3 انجام آبشویی قبل از استفاده از مواد شیمیایی برای ضدعفونی .......................................... 27 شکل 3-4 شیشه­های حاوی ریز نمونه پپرومیا .................................................................................. 27 شکل 3-5 نگهداری ریز نمونه­ها در شرایط مطلوب ایجاد شده در اتاق رشد ................................... 28 شکل 3-6 گیاهچه­های پپرومیای کشت بافتی منتقل شده به گلدان .................................................... 32 شکل 4-1ریزنمونه كشت شده در آزمایش فسفات ............................................................................ 37 شکل 4-2 ريشه­هاي ايجاد شده بر روي ريزنمونه برگی گیاه پپرومیا ................................................. 38 شکل 4-3 ریزنمونه ریشه­دار شده پپرومیا در محیط تلقیح شده با باکتری .......................................... 43 شکل 4-4 ريزنمونه پپرومیا تلقیح شده با تیمار باکتریایی محرک رشد ............................................... 43 شکل 4-6 اندام­زایی مستقیم قطعات برگی گیاه پپرومیا (ریشه­زایی) ................................................... 60

 

جدول علائم و اختصارها:

 

معادل فارسی	معادل انگلیسی	علامت
ام اس	Murashic and Skoge	MS
آی ای ای	Indol Acetic Acid	IAA
ای بی ای	Abscisic Acid	ABA
ان ای ای	Naftalin Acetic Acid	NAA
آی بی ای	Indol Butyric Acid	IBA
پی جی پی آر	Plant Growth Promoting Rhizobacteria	PGP

 

چکیده:

باکتری­های محرک رشد گیاهی به عنوان یکی از راه­های افزایش رشد گیاه شناخته می­شوند. امکان استفاده از این موجودات در تحقیقات آزمایشگاهی گیاهی از جمله کشت بافت گیاهی هنوز در حال بررسی است. با توجه به اینکه این میکروارگانیزم­ها انواع مواد (از جمله اكسين، سيتوكينين، جيبرلين و سیدروفورها) را به محیط اضافه می­کنند، احتمال اینکه بر روی مراحل مختلف کشت بافت از ایجاد کالوس تا مرحله انتقال به خاک اثرات مثبتی داشته باشند وجود دارد. هدف از این تحقیق بررسی اثرات دو باکتری محرک رشد گیاهی بر روی تکثیر گیاه پپرومیا از طریق کشت بافت بود. آزمایش به صورت طرح فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملا تصادفی با سه تکرار اجرا شد. فاکتور باکتری محرک رشد شامل سطوح: 0: شاهد (بدون باکتری)، 2: Azospirillum lipoferrum، 3:Pseudomonas fluorescentو فاکتور هورمون شامل: 0: بدون هورمون، 1: سطح هورمون برابر با 5/1 میلی­گرم در لیتر IAA و 1 میلی­گرم در لیتر 2IP و 2: مقدار هورمون دو برابر غلظت قبلی بودند. قبل از کشت مقدار 08/0 میلی لیتر از کشت مایع باكتري­ها، بر روی محیط کشت تلقیح شد و سپس جوانه­های پپرومیا در محیط­های مذکور کشت شدند. بعد از گذشت 4 هفته از کشت، جوانه­های کشت شده گیاه پپرومیا به اندازه کافی رشد کرده و قابل انتقال به خاک شدند. قبل از انتقال گیاهچه­های جوان به گلدان و بعد از طی کردن مراحل سازگاری اندازه­گیری صفات مورد نظر انجام شد. نتایج نشان داد در آزمایش درون شیشه­ای اثر متقابل هورمون و باکتری بر کل طول ریشه و میانگین طول ریشه معنی­دار بود. تیمارAzospirillum بدون هورمون دارای بیشترین طول ریشه بود و اختلاف معنی دار با دیگر تیمارها داشت. اثر اصلی باکتری بر طول ساقه و تعداد برگ معنی­دار بود. مشاهده شد تلقیح ریزنمونه­ها با هر دو باکتری نسبت به شاهد باعث افزایش معنی­دار طول متوسط شاخه­های باززا شده گردید. افزایش طول ساقه در تیمارهای باکتری نسبت به شاهد در حدود 5/1 برابر بود. در مرحله سازگاری، اثرمتقابل هورمون و باکتری بر تعداد برگ، توسعه برگی و وزن خشک و اثر باکتری بر وزن تر و اثر هورمون بر کل طول ریشه و وزن خشک معنی­دار بود. در کل تلقیح با باکتری تاثيرات مثبتی بر تعداد برگ، توسعه برگی، طول شاخه و طول ریشه داشت. ولی تاثیر منفی تلقیح باکتری بر وزن تر و خشک مشاهده گردید. افزایش سطح هورمون تاثیر مثبت بر طول کل طول ریشه داشت.

 

کلمات کلیدی:کشت بافت،lipoferrum Azospirillum، Pseudomonas fluorescent، فيتوهورمون، پپرومیا.

 

فصل اول

کلیات تحقیق

 

1-1 گیاه­شناسی پپرومیا

گیاه پپرومیا (برگ قاشقی) از جنسPeperomia و خانواده Piperaceae می­باشد. این جنس دارای بیش از ۱۰۰۰ گونه مختلف از گیاهان همیشه­سبز بالارونده است که اغلب آنها برگ­های زیبایی دارند. گونه مذکور بومی نواحی استوایی آمریکا بوده و گیاهی است بسیار کم رشد که ارتفاع آن به حدود ۸ تا ۲۵ سانتی­متر مي­رسد. برگ­های آن بسیار زیاد و قلبی شکل می­باشند که از قسمت مرکزی گیاه خارج می­شوند. برگ­های پپرومیا صورتی کمرنگ می­باشد. گل­ها به رنگ سفید و به شکل گل آذین سنبله مانند و به طول ۱۲ تا ۱۵ سانتی­متر هستند و از اوایل بهار تا اواخر پاییز به چشم می­خورند. این گیاه به نور متوسط، حرارت زیاد، خاک همیشه مرطوب، رطوبت ۵۰ تا ۹۰ درصد و خاک قلیایی احتیاج دارد. کود مورد نیاز این گیاه را می‌توان به میزان ۲ گرم در لیتر، هر دو هفته یکبار از فروردین تا مهرماه، مورد استفاده قرار داد (کریمی، 1390).

 

1-2 نگهداری گیاه پپرومیا

پپرومیا گیاهی است گرمسیری با برگ­های چرمی شکل و قاشقی (شکل1-1)، این گیاه دارای نیاز آبی کم (بسته به شرایط محیط) می­باشد، و همچنین نیاز نوری کمی دارد و سایه آپارتمان را به خوبی تحمل می­کند، هم بصورت مجزا و هم در کاشت گروهی زیباست. این گیاه اگرچه رشد سریعی ندارد، ولی در هر شرایطی در آپارتمان پرورش می­یابد. معمولا آن­ها را در تراریوم و باغ شیشه­ای یا مجموعه­ی گل­های یک سبد پرورش می­دهند. با توجه به شکل ظاهری و نحوه­ی رشد آنها را به سه گروه تقسیم نموده­اند: گروه اول: بوته­ای که دارای دمبرگ­های قرمز هستند، بعضی نیز برگ­های گوشتی و قلبی شکل دارند، گروه دوم: دارای ساقه­های بلند و قرمز رنگ هستند و بعضی ساقه­های گوشتی دارند و لبه برگ­ها ارغوانی است و گاه سطح برگ با موهای بسیار ظریفی پوشیده شده است. گروه سوم: گروه بالارونده که به داربست یا قیم بسته می­شوند و بالا می­روند، با اینکه از گلدان آویزان می­شوند و دارای ساقه­های قرمز و بسیار ظریف نقره­ای و بعضی دارای برگ­های سبز آبدار هستند و بخصوص برای گلدان­های آویز بسیار مناسبند. گیاه پپرومیا یک ساقه گل­دهنده با شاتون­های سبز رنگ تولید می­کند که ارزش زینتی ندارد، زمانی که این گیاه به گل می­رود، کیفیت برگ­ها و زیبایی آن کمتر می­شود، با حذف ساقه­های گل­دهنده می­توان گیاه را مرتب به حالت رویشی و نونهالی مشاهده کرد. این گیاه به سرمای زیاد مقاومت ندارد و حداکثر می­تواند در زمستان 15 درجه سانتی­گراد را تحمل نماید و در فصل رشد دمای 24 تا 30 درجه برای آن بسیار مناسب است. این گیاه در زیر تابش اشعه فلورسنت پژمرده می­شود و نیاز چندانی به آب ندارد و همیشه مقدار زیادی آب در برگ­های آن وجود دارد و سطح خاک گلدان بین دو آبیاری باید کاملا خشک شود، ولی نباید آبیاری آنقدر به تعویق افتد که برگ­ها پژمرده شوند. در زمستان به آب ولرم نیاز دارد و مقدار آبیاری باید بسیار کمتر باشد، ریشه آن سطحی است و گسترش چندانی ندارد و در هوای آلوده، زرد و خشک می­شود، در صورت آب دادن زیاد اطراف یقه ساقه، موجب پوسیدگی اطراف آن می­شود. میزان رطوبت هوای لازم برای این گیاه حدود 50 درصد است، چنانچه رطوبت و حرارت و سرما از حد خود تجاوز کند، لکه­هایی بر سطح برگ ظاهر می­شوند، برگ را بی­حس می­کنند و می­افتد. هر دوماه یکبار سطح خاک گلدان را باید خراش داد تا هوا به داخل آن نفوذ کند و در فصل بهار گلدان را در فضای آزاد در محلی سایه قرار دهید تا حالت طبیعی خود را به دست آورد. هر اندازه قابلیت نفوذ خاک این گیاه بیشتر باشد ریشه و ساقه از پوسیدگی محفوظ خواهد بود. بهتر است برای تهیه خاک گلدان این گیاه یک قسمت پیت بعلاوه یک قسمت ماسه به همراه یک قسمت خاک باغچه استفاده شود و کف گلدان مقداری ماسه و سنگریزه بریزید، زمان مناسب برای تغییر گلدان این گیاه فصل بهار است. پپرومیای ابلق یا سفید با قلمه­های بذر و ساقه تکثیر می­شود و پپرومیای سبز با قلمه­های برگ و ساقه تکثیر می­شود. بهتر است در بهار و تابستان از قلمه­های یک ساله برای گیاه استفاده نمود و برای این کار قلمه را به میزان 4 تا 5 سانتی­متر در ماسه شسته فرو برده و در محلی که دمای آن 18 درجه باشد در تاریکی قرار می­دهند. در مورد انواع گوشتی آن برگ را روی سطح ماسه خوابانیده و روی آن ماسه شسته می­ريزند، پس از مدتی در انتهای رگبرگ­ها ریشه ظاهر می­شود (کریمی، 1390).

 

1-3 نقش کشت بافت در تکثیر گیاهان

تكنيك كشت بافت گياهي نقش كليدي در انقلاب سبز دوم دارد كه در اين انقلاب تغييرات ژني و بيوتكنولوژي جهت پيشرفت كيفيت و كميت محصولات زراعي بكار مي­روند. اين تكنولوژي براي محدوده وسيعي از گياهان زراعي و گونه­هاي درختي جهت حل مشكلات بكار گرفته شده است. اين روش بواسطه تلاش­هاي مداوم و پيگير تعداد زيادي از دانشمندان كه كارهاي پايه­اي انجام داده­­­اند، ممكن شده است. كشت بافت گياهي اصطلاحي است كه بطور كلي براي رشد درون شيشه­اي و عاري از بيماري گياه بر روي محيط مغذي بكار مي­رود. اين تكنولوژي بر سه اصل اساسي استوار است (باقری و همکاران، 1381):

• قسمتي كه بايد از گياه اصلي جدا شود.
• ريزنمونه بايد در شرايط شيميايي (محيط كشت) و فيزيكي (محيطي) تعريف شده نگهداري شود.
• شرايط استريل و عاري از آلودگي بايد حفظ شود

 

شکل 1-1 گیاه پپرومیا (برگ قاشقی)

 

دانش امروزي اجازه بكارگيري هر قسمت از گياه را براي شروع كشت مي­دهد. قسمتي از گياه كه براي اين منظور بكار مي­رود ريزنمونه ناميده مي­شود. انتخاب هر قسمت از گياه با توجه به هدف از كشت متفاوت است. مواد و نمونه­هايي كه از محيط خارج جمع­آوري و به آزمايشگاه آورده مي­شوند، در حين انتقال، بهتر است در شرايط مناسب نگهداري شوند تا فعاليت­هاي كاتابوليكي به حداقل برسد. مواد بطور كامل بايد با آب جاري و مايع شوينده شستشو داده شوند (مانند تويين-80[1])، بعد از شستشو و حذف ذرات چسبنده بسته به نوع ريزنمونه مراحل استريل انجام شده و سپس كشت انجام مي­شود. کشت بافت گیاهی یا کشت درون شیشه­ای عبارت است از رشد سلول، بافت و یا اندام گیاهی در یک محیط غذایی مصنوعی استریل که به صورت جامد یا مایع تهیه می­شود، این روش به عنوان یکی از شاخه­های زیست­فناوری، کاربرد گسترده­ای در کشاورزی دارد. در کشت بافت، قسمتی از گیاه به نام قلمه یا ریزنمونه که ممکن است بخشی از ساقه، برگ، جوانه و یا یک سلول باشد، در محیط کنترل شده کشت می­شود. در این نوع کشت، شرایط به گونه­ای است که عاری از هرگونه میکروارگانیسم بوده و رژیم متعادلی از مواد شیمیایی و آلی مورد نیاز رشد گیاه فراهم است. در واقع در کشت درون شیشه­ای محیط کشت بستری برای رشد گیاه است و ترکیبی از مواد شیمیایی و آلی در یک ژل مغذی یا محیط مایع برای رشد سلول­ها و بافت­ها می­باشد (شریفی و همکاران، 1389).

در سال 1838 شوان و شیلدن[2] نظریۀ توتی­پوتنسی[3] را ارائه نمودند. براساس این نظریه، هر سلول گیاهی، هنگامی که در محیط غذایی مصنوعی و شرایط مناسب کشت شود، می­تواند به گیاهی جدید و کامل تبدیل شود. بعد­ها دانشمند آلمانی، هابرلند[4] (1902) برای اولین بار به بررسی این نظریه پرداخت و ادعا کرد که اگر محیط و تغذیه سلول­های کشت شده مناسب باشند، سلول­های کشت شده می­توانند، گیاهان نرمالی را بوجود آورند. اما تلاش­های او در انجام کشت بافت ناموفق بود. او همچنین معتقد بود که قطعه قطعه کردن نامحدود بافت­های گیاهی بر روی قدرت تکثیر سلول­ها تأثیر نمی­گذارد. او استفاده از مایع موجود در کیسه جنینی و تولید جنین­های مصنوعی را از سلول­های رویشی پیشنهاد کرد (احمدیان، 1380). به دلیل تاخیر در کشف هورمون­های گیاهی، کشت بافت گیاهی پس از کشت بافت حیوانی و انسانی شروع شد. اولین کشت موفقیت­آمیز بافت­های گیاهی، توسط وایت[5] در سال 1934 انجام شد. او در سال 1939 اولین کشت موفقيت­آمیز کالوس هویج و توتون را گزارش کرد. اولین هورمون تنظیم­کننده رشد که کشف شد، اکسین بود که موفقیت بزرگی را برای کشت بافت در شرایط درون شیشه­ای به همراه داشت. بعد از کشف تنظیم­کننده رشد کینتین در سال 1955، انگیزه بیشتری برای کشت بافت حاصل شد. بزرگ­ترین مشوق برای استفاده از فنون کشت بافت گیاهی برای تکثیر بسیاری از گونه­ها، ممکن است کار اولیه مورل[6] روی تکثیر ارکیده و کار موراشیگ و اسکوگ[7] در 1964 در ایجاد محیط کشت جدیدی با غلظت بالای نمک­های معدنی بوده باشد (احمدیان، 1380).

 

1-4 ترکیبات محیط­های کشت

محیط کشت یکی از مهم­ترین اجزاء کشت یاخته و بافت گیاهی است. کاربرد موفق فنون کشت بافت گیاهی به میزان زیادی به محیط کشتی با ترکیب صحیح بستگی دارد. ترکیب محیط­های کشت به روش خاص کشت به کار رفته تغییر می­یابد. برای نمونه روش­هایی مانند باززایی گیاهان کامل از یاخته­ها یا بافت­ها نیازمند محیط­های کشتی با ترکیبات مختلف برای آغازش هریک از مراحل توالی تکوینی است. علاوه بر ترکیب آن، نقش مهم دیگر محیط کشت فراهم کردن محیط فیزیکی مناسب برای یاخته­ها و بافت­ها برای رشد می­باشد. برای نمونه محیط­های کشت جامد، نقشی شبیه خاک را از طریق فراهم کردن یک زمینه و حامل فیزیکی که ریزنمونه­های بافت بتوانند تماس با هوا را برای تبادل گاز حفظ نمایند یا جایی که گیاهچه­های باززایی شده بتوانند ریشه دهند، ایفا می­کنند. از سوی دیگر، کشت­های تعلیقی در حال رشد در کشت مایع در حال تکان خوردن، یاخته­ها را قادر می­سازد تا حداکثر تماس را با اجزای محیط کشت حفظ کنند و تبادل گاز­ها تسهیل شود. تمام یاخته­های گیاهی زنده برای حفظ و رشد و نمو نیازمند آب، عناصر غذایی (عناصر معدنی و ترکیبات آلی) و تنظیم­کننده­های رشد گیاهی (هورمون­ها) هستند. ترکیبات محیط­های کشت بافت گیاهی معمولا این نیازمندی­ها را منعکس می­سازند و چندین ترکیب اختصاصی (مانند محیط کشت موراشیک و اسکوگ یا محیط ام. اس) که به طور رایج برای کشت به کار می­روند دارای ترکیبات پایه مشابهی هستند. مواد مورد نیاز برای کشت یاخته گیاهی را می­توان به سه گروه تقسیم کرد که عبارتند از: عناصر غذایی معدنی، عناصر غذایی آلی و تنظیم­کننده­های رشد گیاهی (باقری و همکاران، 1383؛ شریفی و همکاران، 1389).

 

1– 4 – 1 مواد غیر آلی

عناصر غذایی غیر آلی، عناصر معدنی هستند و معمولا بر اساس غلظت­های ضروری به دو گروه تقسیم می­شوند: عناصر پر­مصرف که در مقادیر زیاد (غلظت­های میلی­مول) و عناصر کم­مصرف که تنها در غلظت­های بسیار پایین (میکرومول) ضروری می­باشند. عناصر پر­مصرف شامل: نیتروژن، گوگرد، فسفر، کلسیم، منیزیم، پتاسیم و عناصر کم­مصرف شامل: آهن، بر، کبالت، مس، ید، منگنز، مولیبدن و روی هستند. عناصر غذایی آلی در حالی که گیاهان سبز خود­پرورهستند، ولی بیشتر سیستم­های کشت حداقل در مراحل اولیه، خود­ناپرورمی­باشند و به یک منبع آلی کربن و انرژی نیازمند هستند. کشت­ها برای آغاز توسعه کلروپلاست­ها و فتوسنتز اغلب در روشنایی پرورش داده می­شوند. علاوه بر یک منبع آلی از کربن و انرژی، کشت­های گیاهی ممکن است به مولکول­های آلی پیچیده برای رشد سالم نیز نیازمند می­باشند (خسروشاهلی و همکاران، 1386).

 

1– 4– 2 منبع کربن

قند­ها برای تامین کربن و انرژی به محیط­های کشت گیاهی افزوده می­شوند. ساکارز متداول­ترین قند مورد استفاده در محیط­های کشت گیاهی است، ولی گلوکز، فروکتوز و سوربیتول در برخی از محیط­های کشت مورد استفاده قرار می­گیرند. علاوه بر نقش متابولیکی آن، ساکارز همچنین به عنوان یک اسمزنگهدار عمل می­کند و همراه با عناصر غذایی معدنی به تعادل پتانسیل اسمزی محیط کشت کمک می­کند (شریفی و همکاران، 1389).

 

1 – 4 – 3 ویتامین­ها

ویتامین­های افزوده شده، برای کشت­های یاخته و بافت گیاهی ضروری نیستند، هرچند ویتامین B1 (تیامین) برای کشت­های برخی از گونه­ها سودمند تشخیص داده شده است. با وجود این بیوتین، اسیدپانتوتنیک، اسیدنیکوتینیک (نیاسین)، پیریدوکسین (پیریدوکسول، ویتامین B6)، اسیدفولیک، اسیداسکوربیک (ویتامین C) و توکوفرول (ویتامین E) به برخی از محیط­های کشت افزوده می­شود. افزودن انفرادی عصاره مخمر[8] گاهی اوقات به عنوان منبع ویتامین­ها صورت می­گیرد. الکل قند میواینوزیتول به وفور در محیط­های کشت برای گیاهان تک لپه­ای، بازدانگان و برخی از گیاهان دولپه­ای به کار می­رود. این الکل قندی نقشی را در توسعه دیواده یاخته و غشاء ایفا می­کند (باقري و همكاران، 1383).

 

1 – 4 – 4 آمینو­اسید­ها و مکمل­های آلی

آمينواسيدها هنگام كاهش نيتروژن نقش خود را ايفا مي­كنند. در صورت ناكافي بودن نيتروژن، مكمل نيتروژن آلي كمپلكس مانند كازئين­هيدروليزات (1-1/0 گرم بر ليتر) ممكن است افزوده شود. گلايسين آمينواسيدي است كه عموما استفاده مي­شود. ساير مكمل­هاي آلي عبارتند از شير نارگيل، عصاره مخمر، پپتون و عصاره جو، هرچند محيط­هاي كشت مصنوعي ترجيح داده مي­شوند و مكمل­هاي آلي كه طبيعت شيميايي ناشناخته دارند فقط در مواقع ضروري بكار مي­روند (ابراهیم زاده و همکاران، 1384).

 

1 – 4- 5 تنظیم­کننده­های رشد گیاهی

پنج گروه اصلی از تنظیم­کننده­های رشد گیاهی یا هورمون­های­گیاهی وجود دارد که رشد و تمایزیابی در گیاه را هماهنگ می­کنند و عبارتند از: اکسین­ها، سایتوکینین­ها، جیبرلین­ها، اسید­­آبسزیک و اتیلن. اتیلن به طور عمده در ریزش، پیری گل و رسیدن میوه موثر است و به ندرت در کشت­های بافت گیاهی به کار می­رود. از چهار گروه دیگر هورمون­های گیاهی، اکسین­ها و سایتوکینین­ها به وفور در کشت­های بافت گیاهی به کار می­روند و جیبرلین­ها و اسید آبسزیک گه­گاه مورد استفاده قرار می­گیرند(خسروشاهلی و همکاران، 1386).

 

 

1 – 4 - 6 عامل ژله­ای­کننده

برای کشت بافت نیاز به یک عامل جامدکننده محیطی است تا نمونه به راحتی روی آن قرار گیرد و از غوطه­ور شدن آن جلوگیری به عمل آید (جورج و همکاران، 1987).

 

1– 4 – 6 – 1 آگار

آگار متداول­ترین ژل مورد استفاده در کشت بافت گیاهی است. آگار، پلی­ساکارید پیچیده­ای است که از جلبک قرمز استخراج شده است و از دو بخش آگارز (70 درصد) و آگاروپکتین (30 درصد) تشکیل شده است. آگارز بخش ژل­ساز بوده و شامل پلی­مری از واحد­های مونوساکارید متناوب د-گالاکتوز و 3،6- آنیدروگالاکتوز است. آگار در دمای حدود 100 درجه سانتی­گراد ذوب می­شود و در دمای حدود 35 درجه سانتی­گراد به حالت ژل در می­آید. آگار پایدار است، با اجزای محیط­های کشت واکنش نمی­دهد و به طور طبیعی توسط آنزیم­های گیاهی هضم نمی­شود (ابراهیم زاده و همکاران، 1384).

 

1-5 ظروف کشت

نوع ظروف استفاده شده در کشت بافت اثرات قابل توجهی بر سرعت رشد کشت­ها، کیفیت ساقه­ها و گیاه­چه­های تولید شده و درجه ی شیشه­ای شدن دارد. در این مورد بویژه حجم ظرف، رطوبت هوا در فضای بالای کشت درون ظرف و میزان تبادل گازی با هوای بیرون ظرف اهمیت خاصی دارد (مک کون و سلمر[9]، 1987).

 

1 – 6 انتخاب و تهیه ریزنمونه

زمانی که گیاه دهنده ریزنمونه در گلخانه یا اتاقک رشد پرورش می­یابند، گیاهان در تمام طول سال در مرحله مناسبی از رشد می­توانند در دسترس باشند. اما ریزنمونه­های حاصل از درختان فقط زمانی برای ریزازدیادی در شرایط مطلوب هستند که به موقع جمع­آوری شوند. نگه­داری مواد گیاهی جمع­آوری شده در زمان مناسب، طول دوره­ای را که از آن می­توان استفاده نمود افزایش می­دهد (احمدیان، 1380).

 

1 – 7 ریزازدیادی

سه نوع اصلی ریزازدیادی عبارت­اند از: 1- رشد طولی ساقه جانبی (پرآوری) 2- اندام­زایی 3- جنین­زایی

رشد طولی ساقه جانبی زمانی انجام می­شود که جوانه­های جانبی که بطور معمول غیرفعال­اند، از غالبیت انتهایی رهایی یابند. این کار بیشتر از طریق تغییر هورمون­ها (اساساً سایتوکینین­ها) در محیط کشت غذایی اعمال می­شود. برای رشد طولی ساقه جانبی، فراوان­ترین نوع ریزنمونه قطعات کوچک ساقه یا تک گره است. میزان تشکیل ساقه جانبی گاهی اوقات پس از چند واکشت افزایش می­یابد (خسروشاهلی و همکاران، 1386).

در اندام­زایی ساقه­های نابجایی القاء می­شوند که سپس ریشه­دار می­گردند. در این حالت به ندرت ریشه­ها قبل از ساقه ایجاد می­شوند. در جنین­زایی، جنین­های سوماتیکی از رشد یک سلول ایجاد شده و پس از بلوغ به یک گیاه کامل تبدیل می­شوند.

 

1-8 کودهای زیستی

مسئله استفاده بي­رویه و نادرست از سموم و کودهاي شیمیایی بسیار جدي و از چند جنبه قابل بررسی است. از مهم­ترین آن آسیب زیست محیطی و بهداشتی است. جنبه دیگر نیز بُعد اقتصادي آن است. بقایا و آثار ترکیبات کود شیمیایی در محیط آب و خاك موجب برهم خوردن تعادل اکوسیستم­ها می­شود. این معایب کودهاي شیمیایی و هزینه بالاي تولید آنها باعث شد که تولید کودهاي زیستی مورد توجه جدي قرار گیرد. در نظام­هاي کشاورزي پایدار کاربرد کودهاي زیستی از اهمیت ویژه­اي در افزایش باروري و حفظ حاصلخیزي پایدار خاك برخوردار است. امروزه استفاده از ظرفیت­هاي طبیعی ارگانیسم­هاي مفید خاکزي با هدف بهره­گیري از توانایی و پتانسیل آنها به منظور تولید حداکثر محصول مورد توجه قرار گرفته است (وسی، 2003).

دامنه میکروارگانیسم­هاي خاکزي مورد استفاده در تولید کودهاي زیستی در طول قرن بیستم توسعه بسیاري یافته است و امروزه طیف وسیعی از باکتری­هاي خاکزي (انواع ریزوبیوم، سودوموناس، ازتوباکتر، آزوسپریلوم، باسیلوس و غیره)، قارچ­ها (انواع قارچ­هاي میکوریزي و اندوفیتی) و جلبک­ها با مکانیسم­هاي مختلف براي تولید کودهاي زیستی استفاده می­شوند. با این حال هنوز هم باکتری­ها فراوان­ترین انواع در توليد کودهاي زیستی محسوب می­شوند. امروزه کودهاي زیستی در فرمولاسیون­هاي متفاوت براي محصولات مختلف کشاورزي از قبیل غلات، سبزي و صیفی، گیاهان صنعتی، باغات و گلخانه­ها استفاده می­شوند (اسدی رحمانی، 1389). اهمیت استفاده از PGPR­ها برای گیاهان مختلف به عنوان کود زیستی هر روزه در حال افزایش می­باشد و تحقیقات وسیعی در این مورد در حال اجراست. اما امکان استفاده از این موجودات در تحقیقات آزمایشگاهی گیاهی از جمله کشت بافت گیاهی هنوز در حال بررسی است. با توجه به اینکه این میکروارگانیزم­ها انواع مواد را به محیط اضافه می­کنند، احتمال اینکه بر روی مراحل مختلف کشت بافت از ایجاد کالوس تا مرحله انتقال به خاک اثرات مثبتی داشته باشند وجود دارد. در این مورد گزارش­های بسیار اندکی موجود است و تحقیق بر روی این موضوع ضروری به نظر می­رسد (احمدزاده، 1392).

 

1-9 باکتری­های محرک رشد گیاه (PGPRsها^[10])

باکتری­های ريزوسفري محرك رشد گياه (PGPR)به گروه نامتجانسي از ميكروارگانيزم­ها اطلاق مي­شوند كه سبب افزايش رشد گياه مي­شوند (وسی[11]، 2003). جنس­هاي متعددي از باكتري­ها به عنوان انواع محرك رشد گياه معرفي شده­اند. این باکتری­ها در بسياري از فرايندهاي كليدي بوم نظام از جمله كنترل بيولوژيكي پاتوژن­هاي گياهي، چرخه عناصر غذايي و استقرار گياهچه دخالت دارند و امروزه براي اهداف كشاورزي و جنگل­داري مورد توجه مي­باشند. اين باكتري­­ها ممكن است ريزوسفر، سطح ريشه و يا حتي فضاي بين سلولي را كلونيزه نمايند (مک کلی[12]، 2001).باكتري­هاي ريزوسفري محرك رشد گياه مي­توانند با استفاده از مكانيزم­هاي مختلفي به طور مستقيم و غيرمستقيم در افزايش رشد و عملكرد گياه نقش داشته­اند. در روش غيرمستقيم باكتري­هاي محرك رشد با استفاده از مكانيزم­هاي خاصي اثرات مضر بيماري­هاي گياهي را تعديل نموده و به اين طريق موجب افزايش رشد گياه مي­شوند. در روش مستقيم اين باكتري­ها با تثبيت آزادزي نيتروژن، توليد متابوليت­هاي موثر در رشد گياه، مانند هورمون­هاي گياهي (اكسين، سيتوكينين، جيبرلين)، انواع ويتامين­ها بخصوص ويتامين­هاي گروه B و انواع اسيدهاي آمينه مثل آرژنين، ليزين، تريپتوفان و بيوتين، افزايش حلاليت تركيبات نامحلول مثل فسفر و پتاسيم از طريق توليد اسيدهاي معدني و آلي، توليد سيدروفورها و افزايش فراهمي عناصر كم مصرف به ويژه آهن و توليد آنزيم ACC دآميناز موثر در كاهش اثرات سوء اتيلن تنشي به رشد بهتر گياه كمك مي­كنند (گلیک و همکاران[13]، 2001).

باكتري­هاي ريزوسفري محرك رشد گياه مي­توانند با استفاده از مكانيزم­هاي مختلفي به طور مستقيم و غيرمستقيم در افزايش رشد و عملكرد گياه نقش داشته باشند. در روش غيرمستقيم باكتري­هاي محرك رشد با استفاده از مكانيزم­هاي خاصي اثرات مضر بيماري­هاي گياهي را تعديل نموده و به اين طريق موجب افزايش رشد گياه مي­شوند. در روش مستقيم اين باكتري­ها با تثبيت آزادزي نيتروژن، توليد متابوليت­هاي موثر در رشد گياه، مانند هورمون­هاي گياهي (اكسين، سيتوكينين، جيبرلين)، انواع ويتامين­ها بخصوص ويتامين­هاي گروه B و انواع اسيدهاي آمينه مثل آرژنين، ليزين، تريپتوفان و بيوتين، افزايش حلاليت تركيبات نامحلول مثل فسفر و پتاسيم از طريق توليد اسيدهاي معدني و آلي، توليد سيدروفورها و افزايش فراهمي عناصر كم مصرف به ويژه آهن و توليد آنزيم ACC دآميناز موثر در كاهش اثرات سوء اتيلن تنشي به رشد بهتر گياه كمك مي­كنند (گلیک و همکاران[14]، 2001).

باكتري­هاي آزادزي خاك كه براي گياهان مفيد هستند، اغلب شامل تعدادي از باكتري­هاي مختلف نظير Azotobacter،Azospirillum،Pseudomonads ، Acetobacter،Burkholderia ، Bacilliو غیره هستند. باكتري­هايPGPR مي­توانند روي رشد و نمو گياه به دو طريق غير مستقيم و يا مستقيم تاثير داشته باشند. تحريك غيرمستقيم رشد گياه موقعي رخ مي­دهد كه باكتري­ها، برخي از اثرات مضر يك موجود بيماريزا را توسط يك يا چند مكانيسم كاهش داده يا از عمل آن جلوگيري به عملآورند. به عبارت ديگر، تحريك مستقيم رشد گياه توسطPGPR معمولاً شامل تامين گياه با يك تركيب سنتز شده توسط باكتري يا تسهيل جذب عناصر غذايي از محيط مي­باشد. چون بسياري از تركيبات شيميايي كه جهت جلوگيري از آفات و بيماري­ها در گياهان استفاده مي­شوند براي حيوانات و انسان خطرناك هستند و مي­توانند در اكوسيستم­هاي طبيعي ماندگار شده و تجمع پيدا كنند، بنابراين مواد شيميايي در حال جايگزين شدن با روش­هاي بيولوژيكي (استفاده ازPGPRبيوكنترل) بي­خطر براي محيط زيست جهت تحريك رشد گياه هستند (وسی، 2003). خصوصيات مرتبط با بيوكنترل عوامل بيماري­زاي گياهي عبارتند از:

1- سنتز آنتي­بيوتيك

2- ترشح سايدروفور (كلاته كننده آهن) جهت به دست آوردن آهن محلول از خاك و تامين آن براي گياه و بنابراين محروم كردن عوامل بيماري­زاي قارچي در كسب آهن محلول

3- توليد (باقری و همکاران، 1381)متابوليت­هاي با وزن مولكولي كم نظير هيدروژن سيانيد با فعاليت ضد­قارچي

4- توليد آنزيم­هاي كتيناز، بتا-1،‏3-گلوكاناز، پروتئاز يا ليپاز كه ديواره عده­اي از سلول­هاي قارچي را مي­توانند ليز كنند.

5- رقابت با عوامل بيماري­زاي گياهي براي عناصر غذايي و محل­هاي روي سطح ريشه

6- كاهش توليد اتيلن تنشي (ناشي از حمله عامل بيماري­زا در گياهان با آنزيم ACC دآميناز) (وسی، 2003).

 

1-10 مکانیسم عمل PGPR ­ها

باكتري­هاي ريزوسفري محرك رشد گياه مي­توانند با استفاده از مكانيزم­هاي مختلفي به طور مستقيم و غيرمستقيم در افزايش رشد و عملكرد گياه نقش داشته­اند. در روش غيرمستقيم باكتري­هاي محرك رشد با استفاده از مكانيزم­هاي خاصي اثرات مضر بيماري­هاي گياهي را تعديل نموده و به اين طريق موجب افزايش رشد گياه مي­شوند. در روش مستقيم اين باكتري­ها با تثبيت آزادزي نيتروژن، توليد متابوليت­هاي موثر در رشد گياه، مانند هورمون­هاي گياهي (اكسين، سيتوكينين، جيبرلين)، انواع ويتامين­ها بخصوص ويتامين­هاي گروه B و انواع اسيدهاي آمينه مثل آرژنين، ليزين، تريپتوفان و بيوتين، افزايش حلاليت تركيبات نامحلول مثل فسفر و پتاسيم از طريق توليد اسيدهاي معدني و آلي، توليد سيدروفورها و افزايش فراهمي عناصر كم مصرف به ويژه آهن و توليد آنزيم ACC دآميناز موثر در كاهش اثرات سوء اتيلن تنشي به رشد بهتر گياه كمك مي­كنند.اهمیت استفاده از PGPR ها برای گیاهان مختلف به عنوان کود زیستی هر روزه در حال افزایش می­باشد و تحقیقات وسیعی در این مورد در حال اجراست. اما امکان استفاده از این موجودات در تحقیقات آزمایشگاهی گیاهی از جمله کشت بافت گیاهی هنوز در حال بررسی است. با توجه به اینکه این میکروارگانیزم­ها انواع مواد را به محیط اضافه می­کنند، احتمال اینکه بر روی مراحل مختلف کشت بافت از ایجاد کالوس تا مرحله انتقال به خاک اثرات مثبتی داشته باشند وجود دارد. در این مورد گزارش­های بسیار اندکی موجود است و تحقیق بر روی این موضوع ضروری به نظر می­رسد. گلیک (2001) عوامل پروبيوتيك از نظر عملكرد به دو گروه اصلي تقسيم مي­شوند:

1- عواملي كه به‌طور مستقيم با مكانيزم‌هاي مختلف بر رشد گياهان و جوانه­زني بذور يا بهبود توليد محصولات تاثير مي‌گذارند.

2- عواملي كه از طريق كنترل بيمارگرهاي گياهي به‌طور غيرمستقيم براي رشد گياهان مفيد هستند.

 

<!--StartFragment--> <!--EndFragment-->