چکیده
مقدمه علایم اختصاری
فصل اول: بررسی منابع
1-1- بیوتکنولوژی پروتئین­های دارویی	1
2-1- کلون­کردن ژن	3
1-2-1- ابزار و عوامل کلون­کردن ژن	4
1-1-2-1- آنزیم­های برشی	4
2-1-2-1- آنزيم DNA لیگاز	5
2-2-1- وکتورهای کلونینگ	6
1-2-2-1- پلاسمیدها	10
3-1- سیستم­های بیان کننده مورد استفاده در تولید پروتئین­های نو­ترکیب	11
1-3-1- باکتری E. coliبعنوان میزبان بيان کنندة پروتئین­های نو­ترکیب	15
2-3-1- وكتور بيان­كننده	15
1-2-3-1- پروموتر	16
1-1-2-3-1- پروموتر T7 و سیستم بیانی PET	17
2-2-3-1- منشاء همانند­سازی	18
3-2-3-1- ماركر انتخابي	18
4-2-3-1- خاتمه دهنده رونويسي	19
5-2-3-1- سيگنالهاي ترجمه يكي از عوامل مؤثر در افزايش بيان	19
6-2-3-1- انتخاب كدون	20
4-1- مسائلي در مورد توليد پروتئين­هاي نو­ترکيب در اشرشياکلي	21
1-4-1- پايداري پلاسميد	21
2-4-1- عدم حذف متيونين در انتهاي N ترمينال پروتئين نو­ترکيب	22
3-4-1- بار متابوليکي	23
4-4-1- مشکلات بيان پروتئين­هاي نوترکيب در سيتوپلاسم باکتري اشرشياکلی.	23
5-1- سيستم ایمنی ذاتی و اكتسابي	25
6-1- سایتوکاین­ها	25
1-6-1- فاکتور نکروز کننده تومور (TNF)	26
1-1-6-1- ويژگي­هاي ژن و مولكول TNFα	27
2-1-6-1- ويژگي هاي ساختاري پروتئين TNF	28
3-1-6-1- ساختار گیرنده TNF و سوپرفاميلي آنها	29
4-1-6-1- نقش بيولوژيكي TNFα	31
5-1-6-1- مكانيسم عمل	31
7-1- TNF-α و نقش آن در برخي از بيماري­های تحلیل عصبي	34
1-7-1- TNF و بیماری آلزایمر(AD)	34
2-7-1- TNF و ایسکمی مغزي	35
3-7-1- TNF و بیماری پارکینسون	36
دستگاه­هاي مورد استفاده
فصل دوم : مواد و روش­ها
1-2- نمونه­گيري از خون انسان	38
2-2- استخراج ­RNAي كل از خون	38
1-2-2- وسايل لازم	38
2-2-2- روش کار	39
3-2- سنتز cDNA	40
1-3-2- روش کار	41
4-2- کلونینگ cDNA­ ی کد کننده TNF-α­ی انسان	41
1-4-2- طراحی جفت پرایمرها	41
2-4-2- واکنش PCR	42
1-2-4-2- الكتروفورز با ژل آگاروز	43
1-1-2-4-2- مواد و وسایل مورد نیاز	43
2-1-2-4-2- روش کار	43
3-1-2-4-2- رنگ­آميزي ژل آگارز با اتيديوم برومايد	43
3-4-2- خالص­سازی محصول PCR با استفاده از كيت	44
4-4-2- کلونینگ cDNA کد کننده TNF-α در وکتور pBR322	45
1-4-4-2- انجام واکنش اتصال	47
2-4-4-2- ترانسفورماسیون محصول اتصال به باکتری	47
3-4-4-2- میزبان باکتریایی E. coli	47
4-4-4-2- کشت و نگهداری باکتری­ها	48
5-4-4-2- تهيه باكتريهاي مستعد (Competent bacteria) براي پذيرش DNA پلاسميديخارجي	49
6-4-4-2- انتقال پلاسمید به درون سلول­های مستعد باکتریایی	50
7-4-4-2- غربال كردن كلون‌هاي واجد پلاسميد نو­تركيب و کشت کلونی باکتریایي.	50
8-4-4-2- استخراج DNA پلاسميدينو­ترکیب	51
9-4-4-2- تایید کلنی­های حاوی اینسرت توسط PCR و آنزیم­های برشی	51
5-4-2- كلونينگ cDN­ی كد­كننده TNF-α در حامل pET21	52
1-5-4-2- برش حامل pET21	52
2-5-4-2- اتصال ­cDNAی TNF-α به حامل pET21	54
6-4-2- انتقال پلاسمید نوترکیب به باكتريE.coli سویهBL21(DH3) برای بررسی پروتئین نوترکیب	54
1-6-4-2- انتخاب کلون­هاي ترانسفورم شده و کشت کلنی­ها	54
5-2- روش­های مربوط به بررسی بیان پروتئین hTNFα نو­ترکیب	55
1-5-2- القاء بیان پروتئین نو­ترکیب	55
2-5-2- تهیه نمونه پروتئینی جهت SDS-PAGE	55
1-2-5-2- SDS-PAGE	56
2-2-5-2- مواد لازم جهت SDS-PAGE	57
3-2-5-2- روش آزمایش	57
3-5-2- وسترن بلاتينگ	59
6-2- نرم­افزارها	61
فصل سوم : نتایج
1-3- نمونه­های خون	62
2-3- استخراج RNA کل از خون	62
3-3- سنتز cDNA كل	63
1-3-3- تکثیر توالی کد­کننده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای انسانی	63
4-3- کلون­سازی توالی کد کننده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای انسانی تکثیر شده با روش PCR در پلاسمید pBR322 و ساخت پلاسمید نو­ترکیب pBRtnf	64
5-3- ساخت پلاسمید بیان کننده نو­ترکیب pET21tnf	67
6-3- بررسی بیان پروتئین نو­ترکیب در E. coli	71
7-3- مقایسه اثر غلظت­های مختلف IPTG در میزان بیان پروتئین	72
8-3- بررسی میزان بیان پروتئین در زمان­های مختلف بعد از القاء	73
9-3- وسترن بلاتینگ	74
فصل چهارم : بحث
4-1- بحث	75
فصل پنجم : نتیجه­گیری و پیشنهادات
نتیجه­گیری و پیشنهادات	80
منابع مورد استفاده	81

 

فهرست جداول عنوان

جدول 1-1 : برخی از پروتئین­های نو­ترکیب موجود در بازار دارویی.............................3

جدول 2-1 : معایب و مزایای سیستم­های بیان کننده مختلف جهت تولید پروتئین­های نوترکیب.......12

جدول 3-1 : تعدادي از پروموترهاي مورد استفاده براي بيان ژن در E. coli..............17

جدول 1-2 :ترکیبات مورد نیاز در سنتز cDNA.........................................................40

جدول 2-2 : ترکیب واکنش PCR(مقادير بر حسب ميكروليتر)...................................42

جدول 3-2 : واکنش برش آنزيمي.................................................................................46

جدول 4-2 : ترکیبات واکنش اتصال TNF-αو pBR322......................................47

جدول 5-2 : فهرست سويه‌هاي E. coli استفاده شده در اين تحقيق..........................47

جدول 6-2 : ترکیبات محیط کشت LB.......................................................................48

جدول 7-2 : مخلوط واكنش براي برش آنزيمي............................................................54

جدول 8-2 : اجزاي واكنش اتصال................................................................................54

جدول 9-2 : تهیه12میلی­لیتر محلول ژل پایین با غلظت 10 در صد...........................57

جدول 10-2 : تهیه5میلی لیتر محلول ژل بالا با غلظت 4 در صد...............................57

جدول 11-2 : ترکیبات بافر نمونه (5x).......................................................................57

جدول 12-2 : ترکیبات بافرالکترود (بافر مخازن).........................................................57

 

فهرست اشكال

شکل 1-1 : اجزاء اوليه و اصلي وكتور بيان­كننده ژن درE. coli......................................16

شکل 2-1: نقشه كروموزوم MHC انسان و ژن hTNFα................................................27

شکل 3-1 : ساختار كريستالي TNFα بر گرفته از Protein Data Bank....................29

شکل 4-1 : شکل 4-1 مسیر سیگنالی TNFR1...............................................................33

شکل 1-2 : نقشه فیزیکی پلاسمید pBR322 (اقتباس از فرمنتاس)................................46

شکل2-2 : نقشه فیزیکی پلاسمید pET21a (+) (اقتباس از فرمنتاس)...........................53

شكل 1-3 : چهار نمونه خون انسان سالم..........................................................................62

شکل 2-3 : الکتروفورز RNA کل استخراج شده از 4 نمونه خونبا استفاده از کیت......63

شکل 3-3 : الکتروفورز محصول تکثیر شده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای نو­ترکیب با روش PCR و با پرایمرهای R و F بر روی ژل آگارز......................................64

شکل 4-3 : نقشه پلاسمید نوترکیبpBR322tnf ..........................................................65

شکل 5-3 : الگوی برش نخورده پلاسمیدهای نو­ترکیب pBRtnf در مقایسه با pBR322 فاقد cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفا.....................................................................66

شکل 6-3 : الکتروفورز محصول واکنش PCR بر روی پلاسمیدهای نو­ترکیب بر روی ژل آگارز.........67

شكل 7-3 : نقشه پلاسمید نوترکیب pET21tnf.............................................................68

شکل8-3 : نتایج الکتروفورز محصول PCRپلاسمید نو­ترکیب pETtnf با پرایمرهای R و F بر روی ژل آگارز...................................................................................................................................................69

شکل 9-3 : الکتروفورز محصول پلاسمید نوترکیب pET21tnf برش يافته با آنزیم های NdeI، HindIII و بریده شده با دو آنزیم NdeI- HindIIIبر روی ژل آگارز..............70

شکل10-3 : توالی نوکلئوتیدی ژن TNF و اسیدآمینه­ای ترجمه شده آن از یکی از کلون های نو­ترکیب به دست آمده، pET21tnf...............................................................71

شکل 11-3 : بیان ژن TNF-α انسانی در BL21E. coli.............................................72

شکل 12-3 : مقایسه غلظت­های مختلف IPTG بر روی بیان..........................................73

شکل 13-3 : مقایسه بیان پروتئین در زمان­های مختلف بعد از القاء..................................73

شکل 14-3 : نتایج وسترن بلاتینگ بیان پروتئین نوترکیب در غلظت­های 0625/0، 125/0، 5/0و 1 میلی­مولار..74

 

علايم اختصاري:

LB: Luria Bertani

NK cell: Natural killer cell

OD: Optical Density

TNF: Tumor Necrosis Factors

TAE: Tris-acetate EDTA

SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophoresis

RT-PCR: Reverse transcription polymerase chain reaction

rhTNF-α: Recombinant human Tumor Necrosis Factor alpha

MCS: Multiple cloning site

LPS: Lipopolysaccharide

IPTG: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

IL: Interleukin

INF: Interferon

EDTA: Ethylene diamine tetra acetic acid

DW: Distilled water

APS: Ammonium persulfate

MS: Multiple Sclerosis

TEMED: N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine or N,N,N,N-Tetramethyl-1,2-diaminoethan

TE: Tris EDTA

TM: Melting temperature

RCLB: Red Cell Lysis Buffer

CTL : Cytotoxic T cell

X-gal: bromo-chloro-indolyl-galactopyranoside

MHC: Major Histocompatibility Complex

AD: Alzheimers disease

PD: Parkinsons disease

LT: Lymphotoxin

TLR: Toll-like receptor

FADD: Fas-Associated protein with Death Domain

RIP: Receptor Interacting Protein

 

 

چکیده

سایتوکاین ها خانواده اي از فاكتورهاي رشد هستند که توسط سلول های سيستم ایمنی ترشح می شوند. این خانواده شامل اینترلوکین ها (IL)، اینترفرون ها (IFN)، فاکتور نکروز کننده تومور (TNF)، کموکاین ها و سایر فاکتورهای رشد میباشند. فاکتور نکروز کنندۀ تومور، بعنوان يك مولکولی با خصوصیات آنتی توموری است که عمدتاً توسط ماکروفاژهاي تحريك شده با باکتری ترشح میشود. عليرغم ابنكه مقادير محدودي TNF-α از منابع طبیعی آن بدست مي آيد اما مقادیر زیادی از فرم محلول آن (مورد نیاز برای مطالعات ساختاری و عملکردی) را میتوان به آسانی توسط تکنولوژی DNA نوترکیب به دست آورد. بنابراين ترجیح داده میشود براي توليد اين پروتئین نوترکیب از سیستم های ساده ميكروبي و نيز گیاهان استفاده گردد.

در اينجا به منظور مطالعه بیان TNFα انسانی، cDNA کد کنندۀ hTNFα حاصل از RT-PCR ي mRNA سلول های ماکروفاژ انسان، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی از قبل طراحی شده تکثیر گردید. محصول PCR خالص سازی شده، در سايت برشي EcoRV که در داخل ناحیه کد کننده مقاومت به تتراسایکلین در pBR322 بود، الحاق شد. سرانجام به منظور بيان، ژن هدف در پلاسمیدتحت کنترل سیگنال های رونویسی و ترجمه قوی پروموتور باکتریوفاژT7كلون گرديد به اين ترتيب كه وكتور نوتركيب و نيز هر دو با آنزيم هاي NdeI-HindIII بريده شده و قطعهDNA bp 478 حاصل از برش pBRtnf در pET21a(+) خطي شده، اتصال و سپس در E. coli DH5α ترانسفورم شد. پس از بررسي صحت کلونینگ (توسط تکنیک PCR و آنزیم های برشی) و توالی یابی قطعه کلون شده، بیان سیتوپلاسمی hTNFα نوترکیب در سویه BL21(DE3) E.coliاز طریق تکنیک های SDS-PAGEو نيز وسترن بلاتینگ مورد تاييد قرار گرفت.

 

مقدمه

فاکتور نکروز کننده تومور آلفا (TNF-α) سایتوکایني پیش التهابی است كه در راه اندازی و تنظیم سيستم ايمني ذاتی و پاسخ های التهابی حاد در برابر باکتری های گرم منفی و سایر میکروب هاي بیماری زا از طريق فراخواني نوتروفیلها و منوسیت ها به محل عفونت دخالت دارد. TNF-α براي اولين بار از سرم موش ها و خرگوشهایی که با سویه BCG مایکوباکتریوم بوویس يا آندوتوكسين باكتري ها تيمار شده بودند جداسازي شد كه در مرگ سلول هاي توموري نقش ايفاء مي كرد. اگر چه وجه تسمیه این فاکتور به علت ویژگی های ضد توموری آن است اما اين پلی پپتید 17 کیلودالتونی داراي عملكردهاي متعددي نظير دخالت در آپوپتوزیس، زنده ماندن سلول، التهاب، تنظيم خواب و رشد رويان مي باشد.اين فاكتور غالباً توسط ماکروفاژهای فعال، لنفوسیت هایT ي CD4+، لنفوسیت هایT ي CD8+، سلول های NK و ماست سل ها بيان مي شوند. بیان آن در سلول های دیگر مانند فیبروبلاست ها، سلول های عضلات صاف و سلول های توموری پایین است.

TNF-α نوترکیب امروزه به طور گسترده در تحقیقات علوم پایه و بالینی و نيز به منظور درمان تومور مورد استفاده قرار می گیرد. لذا با توجه به اهمیت آن تولید و تخلیص TNF-α به شکل نوترکیب در موجودات پروكاريوتي در كشور می تواند باعث فراهم شدن زمينه جهت انجام تحقیقات بعدی نظير تحقیقات ملکولی، پزشکی و بالینی بر روی این سایتوکاین مهم باشد. به علاوه امکان تولید آنتی بادی های منوکلونال و پلی کلونال برعلیه TNF-α که امروزه کاربردهای بسیار وسیعی در تشخیص و درمان بیماریهای مختلف دارند نيز فراهم می شود. از سوی دیگر با توجه به نقش ویژه TNF-α در مقابله با تومورهای سرطانی، تولید TNF نوترکیب می تواند دریچه ای نوین در برابر تحقیقات سرطان شناسی و نیز درمان تومورهای سرطانی فراروی محققین کشور بگشاید.

1-1- بیوتکنولوژی پروتئین­های دارویی

بیوتکنولوژی (زیستفناوری)، مجموعه فنونی است که از سیستم زنده برای تولید یا تغییر فرآورده­های زیستی در جهت بهداشت و اقتصاد عمومی استفاده می­کند(Wallman, 1997). گر­چه استفاده از میکروارگانیسم­ها برای تولید فرآورده­های زیستی دارای سابقه طولانی است ولی در زمینه بیوتکنولوژی مدرن امروزینظیر تکنیک­های مهندسی ژنتیک و تکنولوژی DNAنو­ترکیب، کاربرد فراوان دارند. اصطلاح بیوتکنولوژی نخستین بار در سال 1917توسط کارل ارکی[1] به کار برده شد. در سال 1973 هربرت بویر[2] و استنلی کوهن[3] تکنولوژی DNA نو­ترکیب را ارایه دادند و در سال 1976 اولين شركت مستقل بيوتكنولوژي،­Genentech، به منظور تجاري كردن اين تكنولوژي جديد تاسيس شد. در سال 1982 انسولین انسانی نو­ترکیب با استفاده از تكنولوژي DNA نوتركيب براي نخستين بار در E. coli به مرحله تولید رسید(Mckown and Coffman, 2002).پیش از بکار بردن روشهای بیوتکنولوژی، تنها منبع تولید پروتئین­های دارویی منابع طبیعی آنها نظیر خون و بافت­های انسانی و حیوانی بود که اغلب به میزان بسیار اندک و با صرف هزینه بسیار بالا تهیه می­شد. همچنین به دلیل مشکل بودن روشهای خالص سازی و از طرفی آلرژی­زا بودن پروتئین­های حیوانی برای انسان و امکان بروز اثرات جانبی، استفاده از این ترکیبات را محدود می­نمود(Brown, 2001). امروزه تکنولوژی DNA نو­ترکیب امکان آن را فراهم کرده است که بتوان cDNA کد کننده هر پروتئین را جدا کرده و به یک سیستم بیان کننده مناسب وارد کرد. در این حالت پروتئین مورد نظر در موجود بیگانه که اغلب یک میکروارگانیسم است،

 

 

بیان می­شود(Glick and Eds, 1998). به این ترتیب می­توان پروتئین­های دارویی را در مقیاس انبوه و بسیار ارزان­تر از روش­های قبلی تولید نمود(Walsh and Headon, 1994).

در حال حاضر بیش از 100 پروتئین دارویی نو­ترکیب برای درمان بیماری­های انسانی در بازار وجود دارد و در حدود 400 داروی جدید در درمان بیماری­های مختلف به ویژه سرطان، ایدز و ناراحتی­های دستگاه عصبی در مراحل کار آزمایی بالینی قرار دارند(Mckown and Coffman, 2002).

تکنولوژی دارویی مدرن از کلون کردن ژن و تکنولوژی DNA نوترکيب بهره می­گيرد. هدف نهايی بيوتکنولوژی دارويی ژن درمانی و ورود مواد ژنتيکی به سلول­ها برای جلوگيری يا کنترل و يا معالجه بيماری می­باشد(Ossege, Sindern et al., 1998). جدول 1-1 برخی از پروتئین­های دارویی تولید شده به صورت نو­ترکیب (T. A. Brown) را نشان می­دهد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 1-1: برخی از پروتئین­های نو­ترکیب موجود در بازار دارویی (T. A. Brown)

Used in the treatment of	Protein
Diabetes	Insulin
Growth disorders	Somatostatin
Growth disorders	Somatrotropin
Haemophilia	Factor VIII
Christmas disease	Factor IX
Leukamia and other cancers	Interferon-α
Cancers, AIDS	Interferon-β
Cancers, rheumatoid arthritis	Interferon-γ
Cancers, immune disorders	Interleukins
Cancers	Granulocyte colony stimulating factor
Cancers	Tumour necrosis factor
Ulcers	Epidermal growth factor
Ulcers	Fibroblast growth factor
Anaemia	Erythropoietin
Heart attack	Tissue plasminogen activator
Free radical damage in kidney transplants	Suproxide dismutase
Respiratory distress	Lung surfactant protein
Emphysema	1-antitrypsinα
Used as a plasma supplement	Serum albumin
Used to aid childbirth	Relaxin

 

1-2- کلون کردن ژن

كلون كردن عبارت است از به وجود آوردن نسخهکاملاً مشابه يك قسمتكوچكي از DNA، سلول و يا موجود كامل. كلون كردن ژن تحت عناوين كلون كردن مولكولي و تكنولوژيDNA نو­تركيب نيز شناخته مي­شود(Brown 1996). در این تکنیک يك توالي ژني را جدا كرده و با آنزیم اختصاصی برش می­دهند. سپس با استفاده از آنزیمDNA لیگاز[4]DNA مورد نظر در يك وكتور مناسب قرار داده می­شود. هیبرید حاصله را ConstructDNA گویند. که با انتقال به باکتری و یا سلول میزبان امکان تکثیر آن فراهم می­شود(Maeyer and De Maeyer-Guignard, 1998). در سال 1973، نخستین DNA نو­ترکیب با استفاده از آنزیم­های برشی و آنزیم لیگاز در دانشگاه Stanford آمریکا ساخته شد.

کشف تکنولوژی DNA نو­ترکیب سر­آغاز پیشرفت­های جدید در علوم و بیوتکنولوژی شد. یکی از خصوصیات مهم ژن کلون شده در تکنولوژی DNA نو­ترکیب، این است که اغلب می­تواند درون موجودی دیگر که کاملاً متفاوت با موجود اولیه است، فعالیت خود را انجام دهد(Michael and et., 1982). اهميت اصلي كلون كردن ژن به دست آوردن مقادير كافي از ژن­هاي مورد نظر براي تجزيه و تحليل بعدي است و امكان آزمايشات ژنتيكي براي فهم مكانيسم­هاي دخيل در بيماري­هاي ژنتيكي و در نتيجه پيدا كردن راهكارهاي مناسب براي تشخيص و درمان آنها را فراهم مي­آورد. كلون كردن ژن همچنين در داروسازي امروزه براي ساخت داروها با ساختار پروتئين نقش اساسي دارد. در حال حاضر یکی از مهمترین راهکارهای استفادة درمانی از این فناوری در توسعة روش­های درمانی نوین از جمله ژن درمانی است.

1-2-1- ابزار و عوامل کلون کردن ژن

همانطور که قبلاً ذکر شد اساس کلون کردن، برش دادن مولکول­های متفاوت DNA و اتصال دوبارة آنها است. برای این کار ابزارهای مولکولی لازم است که مهمترین آنها آنزیم­های محدود کننده[5] و آنزیم لیگاز هستند.

1-1-2-1- آنزیم­های برشی

در كلون كردن ژن، براي ايجاد يك مولكول DNAي نو­تركيب، ناقل بايستي به صورت کاملاً دقیق در يك نقطه مشخص(با امكان اتصال و برش دوباره) برش داده شود تا قطعه DNA كه قرار است، کلون

 

شود، در آن نقطه وارد گردد. اندونوكلئاز­هاي برشي، آنزيم­هايي هستند كه قطعه DNA را در مكان­هاي اختصاصي برش مي­دهند. اولين آنزيم برشي در سال 1970 از باكتري Haemophilus influenzaeجداسازي شد. انواع مختلف باکتری­ها انواع متفاوتی از این آنزیم­ها را تولید می­کنند. به همین دلیل اسامی آنها معمولاً از نام باکتری­های مولد آنها مشتق شده است(McDonald, 1996).

2-1-2-1- آنزيم DNA لیگاز

يكي از آنزيم­هاي مهم در سلول براي اتصال قطعات، DNA ليگاز ناميده مي­شود که موجب بازسازی پیوندهای فسفودی­استری از هم گسیخته می­گردد. هر گاه DNAي ناقل و DNAي خارجي هر دو با يك آنزيم برشي بريده شوند، نواحي انتهايي متناظر در ناقل و DNAي خارجي با يكديگر سازگار بوده و مكمل يكديگرند. و توالي­هاي تك رشته­اي انتهاهاي مكمل با هم جفت مي­شوند. ليگاز­ها روي قطعات برخوردار از گروه فسفات در انتهاي 5 عمل كرده و با ايجاد پيوند فسفودی­استری سبب بر­قراري اتصال بين دو توالي DNA مي­شوند، اين فرايند كه به اتصال[6] معروف است، آخرين مرحله ساخته شدن يك مولكول DNAي نو­تركيب است.

در کلون کردن ژن­ها نوع آنزيمي كه معمولاً مورد استفاده قرار مي­گيرد، DNA ليگاز T4 است كه از باكتري­هاي E. coliآلوده شده با باكتريوفاژ T4 به دست مي­آيد. زيرا اين آنزيم هم قادر به اتصال رشته هاي DNAي دو رشته­اي با انتهاي صاف و هم با انتهاي چسبان مي­باشد در حالي كه DNA ليگاز باكتري E. coli در اتصال قطعات با انتهاي صاف ناتوان است. دماي بهينه فعاليت هر دو آنزيم در سيستم بيولوژيكي 37 درجه است. ولي از آنجا كه براي اتصال قطعات جدا از هم و مكمل تشكيل اوليه

 

 

پيوندهاي هيدروژني بين نوكلئوتيدهاي مكمل ضروري است و در واكنش درون شيشه­اي[7] پيوندهاي هيدروژني، پايداري چنداني در مقابل دماي بالا ندارند به همين دليل اين نوع واكنش­ها در دماهاي پايين 16-4 درجه سانتيگراد و به مدت طولاني انجام شود(McDonald, 1996).

2-2-1- وکتورهای کلونینگ

براي اين كه بتوان قطعه­اي از DNAي دلخواه (موسوم به Insert DNA) را با استفاده از شرايط طبيعي (in vitro) تكثير كرده و براي مطالعات بيشتر استفاده نمود، لازم است DNA را توسط مولكول­هاي وکتور به سلول­هاي مورد نظر انتقال داد. در غير اين صورت، عمل انتقال، تكثير و يا استخراج DNAي مورد نظر امكان­پذير نمي­شود. نظر به اين كه قطعات تكثير شده همه با هم يكسان هستند، اين نوع متدولوژي به همسانه­سازي DNA موسوم است. مولكول­هاي وکتور DNA(DNAVector) كه خود DNA مي­باشند، بنا به داشتن توالي به خصوصي قادر هستند در سلول­هاي ميزبان خود به تعداد زيادي تكثير شوند. در اين صورت قطعه DNAي دلخواه نيز به همراه وکتور خود تكثير مي­شود.

وكتورهاي DNA تنوع بسيار زيادي دارند. مهمترين عامل طبقه­بندي آنها ميزان ظرفيت حمل DNA به سلول ميزبان است. قطعات DNA را مي­توان از چند نوكلئوتيد گرفته تا بيش از صد هزار نوكلئوتيد توسط وكتورهاي مناسب همسانه­سازي نمود. به همين دليل در طراحي اوليه بايد ابتدا اندازه DNAي مورد نظر را مشخص و وكتور مناسبي انتخاب نمود. پلاسمیدها، فاژλ، کاسمید و کروموزوم­های مصنوعی مخمر(Yeast artification chromosom) از وکتورهایی هستند که بیش از سایر وکتورها مورد استفاده قرار می­گیرد(Larry and Champness, 2007).

 

 

مشخصات كلي وكتورهاي كلونينگ

وكتورهاي مختلف DNA با تنوع بسيار زياد، شامل اندازه­ها و ظرفيت­هاي حمل مختلف موجود مي باشند، ولي داراي نقاط مشترك اساسي ذيل هستند:

· مبدا همانند­سازي[8]

همهوكتورها داراي توالي­هاي ويژه­اي هستند كه توسط آنزيم DNA پلي­مراز سلول ميزبان شناسايي شده و به تعداد بسيار زيادتر از ژنوم خود ميزبان تكثير مي­شوند اين توالي به مبدا همانند­سازي موسوم است وبا Ori نشان داده مي­شود. برخي وکتورها حاوي دو نوع Ori براي تكثير در دو نوع سلول ميزبان مي باشند. همانند­سازي وكتور توسط DNA پلي­مراز سلول ميزبان، در اين ناحيه شروع و در دو جهت (Bi-directional) مخالف هم ادامه مي­يابد.

• نشانگرهای انتخابی[9]

همه وكتورها حامل ژن­هايي هستند كه به واسطه ايفايش آنها مي­توان وجود وكتور را به سهولت در داخل سلول ميزبان رديابي نمود. متداول­ترين نشانگرها، ژن­هايي هستند كه فرآورده آنها باعث بروز مقاومت در برابر آنتي­بيوتيك­هاي به خصوصي مي­شود. در صورتي كه وكتور به داخل سلول ميزبان حساس به يك آنتي­بيوتيك انتقال يابد، مي­تواند در حضور همان آنتي­بيوتيك زنده مانده و رشد كند. انواع نشانگرهاي رايجي كه مقاومت به آنتي­بيوتيك به خصوصي را در سلول ميزبان القاء مي­كنند، آمپي سيلين[10]، تتراسايكلين[11]، جنتامايسين[12]، كانامايسين[13] و استرپتومايسين[14] مي­باشند.

 

 

• نشانگرهای ژنتیکی[15]

دسته ديگري از نشانگرها، ژن­هايي هستند كه عامل كنترل يك سري واكنش­هاي بيوشيميايي هستند. و در حضور مواد زمينه خاصي واكنش­هاي به خصوصي را بر­مي­انگيزند. مثلاً ژن LacZ كه استفاده از آن بسيار متداول مي­باشد در صورت انتقال به سويه­اي از باكتري E. coli كه اين ژن را ندارد باعث توليد آنزيم بتا-گالاكتوزيداز مي­شود كه مي­تواند روي ماده­اي بنام X-Gal اثر کرده و رنگ آبي در محيط اطراف سلول توليد کند. براي تشخيص اينكه سلول ميزبان حاوي وکتور DNA است، استفاده از يك نوع نشانگر كافي است ولي براي اينكه بتوان ماهيت وکتور را در رابطه با حامل بودن DNA وارد شده بررسي نمود، استفاده از نشانگرهاي ثانوي ضروري می­باشد.

• جایگاه کلونینگ متعدد[16] (MCS)

براي اينكه بتوان DNA وارد شده را با استفاده از مكانيسم نوتركيبي[17] وارد قسمت خاصي از DNAي وکتور کرد، در ساده­ترين روش كار لازم است با استفاده از آنزيم­هاي برش دهنده هر دو DNA را برش داده و قطعات برشي و سپس دو نوع DNA را به هم اتصال داد در وکتورهاي جديد جايگاه کلونینگ يا MCS شامل توالي­هايي است كه حاوي توالي­هاي شناسايي و جايگاه برش براي آنزيم­هاي برش دهنده متعدد مي­باشد. در کلونینگ بايد از آنزيم­هايي استفاده كرد كه فقط مي­توانند يكبار DNA وکتور را مورد برش قرار دهند به همين دليل اين جايگاه­ها را جايگاه برشي منحصربه فرد مي­نامند. بنابر اين MCS هر وکتور جايگاه برشي آنزيم­هايي را ارائه مي­كند كه در تمامي طول وکتور منحصر به فرد[18]هستند. اگر­چه وجود MCS در يك وکتور الزامي است اما اين جايگاه بايد در مكان ويژه­اي در روي وکتور قرار گرفته باشد به طور رايج اين محل در ناحيه ´5 ژن LacZ قرار دارد كه وجود آن در اين محل در توليد فرآورده اين نشانگر اختلالي ايجاد نمي­كند در صورت وارد كردن DNA در جايگاه MCS توالي اين ژن مختل شده و عدم توليد كلوني­هاي آبي رنگ در حضور X-Gal وجود DNAي وارد شده را نشان مي­دهد.

• جایگاه­های پروموتر[19]

بسته به هدف کلونینگ، وكتورهاي متفاوتي طراحي شده­اند و به منظور انجام عمليات مختلف، توالی­هاي ويژه­اي در يك يا دو رديف MCS قرار داده شده­اند. اين توالی­هاي اليگو­نوكلئوتيدي محل شناسايي و كنترل آنزيم­هاي مختلف از منابع متفاوت هستند كه در سويه­هاي مختلفE. coli موجود مي­باشند. به اين ترتيب بايستي براي اهداف و عمليات بخصوص، وكتور و سويه باكتري مناسب و سازگاري را انتخاب نمود. ممكن است هدف از کلونینگ توليد و تكثير DNA هدف، توليدmRNA از DNAي هدف يا اين كه توليد فرآورده پروتئيني کد شونده از DNAي هدف باشد. وجود پروموترهاي ويژه و آنزيم­هاي مربوطه انجام اين نوع عمليات را بر­عهده دارند.

Expression Vector