بیتوته پرتابل جامع شامل ،کسب درآمد،و مقالات دانشگاهی

بهترین ها ی اینترنت را از سایت ما دانلود کنید با ضمانت هفت ستاره

اشتراک در خبرنامه

جهت عضویت در خبرنامه لطفا ایمیل خود را ثبت نمائید

Captcha

آمار بازدید

  • بازدید امروز : 123
  • بازدید دیروز : 48
  • بازدید کل : 51566

پیوند ها

كلون و بيان فاكتور نكروز دهنده تومور آلفا (TNF-α)


كلون و بيان فاكتور نكروز دهنده تومور آلفا (TNF-α)

p><!--StartFragment

 


چکیده

 

مقدمه

علایم اختصاری

 

فصل اول: بررسی منابع

 

1-1- بیوتکنولوژی پروتئین­های دارویی

1

2-1- کلون­کردن ژن

3

1-2-1- ابزار و عوامل کلون­کردن ژن

4

1-1-2-1- آنزیم­های برشی

4

2-1-2-1- آنزيم DNA لیگاز

5

2-2-1- وکتورهای کلونینگ

6

1-2-2-1- پلاسمیدها

10

3-1- سیستم­های بیان کننده مورد استفاده در تولید پروتئین­های نو­ترکیب

11

1-3-1- باکتری E. coliبعنوان میزبان بيان کنندة پروتئین­های نو­ترکیب

15

2-3-1- وكتور بيان­كننده

15

1-2-3-1- پروموتر

16

1-1-2-3-1- پروموتر T7 و سیستم بیانی PET

17

2-2-3-1- منشاء همانند­سازی

18

3-2-3-1- ماركر انتخابي

18

4-2-3-1- خاتمه دهنده رونويسي

19

5-2-3-1- سيگنالهاي ترجمه يكي از عوامل مؤثر در افزايش بيان

19

6-2-3-1- انتخاب كدون

20

4-1- مسائلي در مورد توليد پروتئين­هاي نو­ترکيب در اشرشياکلي

21

1-4-1- پايداري پلاسميد

21

2-4-1- عدم حذف متيونين در انتهاي N ترمينال پروتئين نو­ترکيب

22

3-4-1- بار متابوليکي

23

4-4-1- مشکلات بيان پروتئين­هاي نوترکيب در سيتوپلاسم باکتري اشرشياکلی.

23

5-1- سيستم ایمنی ذاتی و اكتسابي

25

6-1- سایتوکاین­ها

25

1-6-1- فاکتور نکروز کننده تومور (TNF)

26

1-1-6-1- ويژگي­هاي ژن و مولكول TNFα

27

2-1-6-1- ويژگي هاي ساختاري پروتئين TNF

28

3-1-6-1- ساختار گیرنده TNF و سوپرفاميلي آنها

29

4-1-6-1- نقش بيولوژيكي TNFα

31

5-1-6-1- مكانيسم عمل

31

7-1- TNF-α و نقش آن در برخي از بيماري­های تحلیل عصبي

34

1-7-1- TNF و بیماری آلزایمر(AD)

34

2-7-1- TNF و ایسکمی مغزي

35

3-7-1- TNF و بیماری پارکینسون

36

دستگاه­هاي مورد استفاده

 

فصل دوم : مواد و روش­ها

 

1-2- نمونه­گيري از خون انسان

38

2-2- استخراج ­RNAي كل از خون

38

1-2-2- وسايل لازم

38

2-2-2- روش کار

39

3-2- سنتز cDNA

40

1-3-2- روش کار

41

4-2- کلونینگ cDNA­ ی کد کننده TNF-α­ی انسان

41

1-4-2- طراحی جفت پرایمرها

41

2-4-2- واکنش PCR

42

1-2-4-2- الكتروفورز با ژل آگاروز

43

1-1-2-4-2- مواد و وسایل مورد نیاز

43

2-1-2-4-2- روش کار

43

3-1-2-4-2- رنگ­آميزي ژل آگارز با اتيديوم برومايد

43

3-4-2- خالص­سازی محصول PCR با استفاده از كيت

44

4-4-2- کلونینگ cDNA کد کننده TNF-α در وکتور pBR322

45

1-4-4-2- انجام واکنش اتصال

47

2-4-4-2- ترانسفورماسیون محصول اتصال به باکتری

47

3-4-4-2- میزبان باکتریایی E. coli

47

4-4-4-2- کشت و نگهداری باکتری­ها

48

5-4-4-2- تهيه باكتريهاي مستعد (Competent bacteria)

براي پذيرش DNA پلاسميديخارجي

 

49

6-4-4-2- انتقال پلاسمید به درون سلول­های مستعد باکتریایی

50

7-4-4-2- غربال كردن كلون‌هاي واجد پلاسميد نو­تركيب و کشت کلونی باکتریایي.

50

8-4-4-2- استخراج DNA پلاسميدينو­ترکیب

51

9-4-4-2- تایید کلنی­های حاوی اینسرت توسط PCR و آنزیم­های برشی

51

5-4-2- كلونينگ cDN­ی كد­كننده TNF-α در حامل pET21

52

1-5-4-2- برش حامل pET21

52

2-5-4-2- اتصال ­cDNAی TNF-α به حامل pET21

54

6-4-2- انتقال پلاسمید نوترکیب به باكتريE.coli سویهBL21(DH3) برای بررسی
پروتئین نوترکیب

54

1-6-4-2- انتخاب کلون­هاي ترانسفورم شده و کشت کلنی­ها

54

5-2- روش­های مربوط به بررسی بیان پروتئین hTNFα نو­ترکیب

55

1-5-2- القاء بیان پروتئین نو­ترکیب

55

2-5-2- تهیه نمونه پروتئینی جهت SDS-PAGE

55

1-2-5-2- SDS-PAGE

56

2-2-5-2- مواد لازم جهت SDS-PAGE

57

3-2-5-2- روش آزمایش

57

3-5-2- وسترن بلاتينگ

59

6-2- نرم­افزارها

61

فصل سوم : نتایج

 

1-3- نمونه­های خون

62

2-3- استخراج RNA کل از خون

62

3-3- سنتز cDNA كل

63

1-3-3- تکثیر توالی کد­کننده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای انسانی

63

4-3- کلون­سازی توالی کد کننده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای انسانی تکثیر شده با روش PCR در پلاسمید pBR322 و ساخت پلاسمید نو­ترکیب pBRtnf

 

 

64

5-3- ساخت پلاسمید بیان کننده نو­ترکیب pET21tnf

67

6-3- بررسی بیان پروتئین نو­ترکیب در E. coli

71

7-3- مقایسه اثر غلظت­های مختلف IPTG در میزان بیان پروتئین

72

8-3- بررسی میزان بیان پروتئین در زمان­های مختلف بعد از القاء

73

9-3- وسترن بلاتینگ

74

فصل چهارم : بحث

 

4-1- بحث

75

فصل پنجم : نتیجه­گیری و پیشنهادات

 

نتیجه­گیری و پیشنهادات

80

منابع مورد استفاده

81

   

 

فهرست جداول

عنوان

جدول 1-1 : برخی از پروتئین­های نو­ترکیب موجود در بازار دارویی.............................3

جدول 2-1 : معایب و مزایای سیستم­های بیان کننده مختلف جهت تولید پروتئین­های نوترکیب.......12

جدول 3-1 : تعدادي از پروموترهاي مورد استفاده براي بيان ژن در E. coli..............17

جدول 1-2 :ترکیبات مورد نیاز در سنتز cDNA.........................................................40

جدول 2-2 : ترکیب واکنش PCR(مقادير بر حسب ميكروليتر)...................................42

جدول 3-2 : واکنش برش آنزيمي.................................................................................46

جدول 4-2 : ترکیبات واکنش اتصال TNF-αو pBR322......................................47

جدول 5-2 : فهرست سويه‌هاي E. coli استفاده شده در اين تحقيق..........................47

جدول 6-2 : ترکیبات محیط کشت LB.......................................................................48

جدول 7-2 : مخلوط واكنش براي برش آنزيمي............................................................54

جدول 8-2 : اجزاي واكنش اتصال................................................................................54

جدول 9-2 : تهیه12میلی­لیتر محلول ژل پایین با غلظت 10 در صد...........................57

جدول 10-2 : تهیه5میلی لیتر محلول ژل بالا با غلظت 4 در صد...............................57

جدول 11-2 : ترکیبات بافر نمونه (5x).......................................................................57

جدول 12-2 : ترکیبات بافرالکترود (بافر مخازن).........................................................57

 

فهرست اشكال

شکل 1-1 : اجزاء اوليه و اصلي وكتور بيان­كننده ژن درE. coli......................................16

شکل 2-1: نقشه كروموزوم MHC انسان و ژن hTNFα................................................27

شکل 3-1 : ساختار كريستالي TNFα بر گرفته از Protein Data Bank....................29

شکل 4-1 : شکل 4-1 مسیر سیگنالی TNFR1...............................................................33

شکل 1-2 : نقشه فیزیکی پلاسمید pBR322 (اقتباس از فرمنتاس)................................46

شکل2-2 : نقشه فیزیکی پلاسمید pET21a (+) (اقتباس از فرمنتاس)...........................53

شكل 1-3 : چهار نمونه خون انسان سالم..........................................................................62

شکل 2-3 : الکتروفورز RNA کل استخراج شده از 4 نمونه خونبا استفاده از کیت......63

شکل 3-3 : الکتروفورز محصول تکثیر شده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای نو­ترکیب با روش PCR و با پرایمرهای R و F بر روی ژل آگارز......................................64

شکل 4-3 : نقشه پلاسمید نوترکیبpBR322tnf ..........................................................65

شکل 5-3 : الگوی برش نخورده پلاسمیدهای نو­ترکیب pBRtnf در مقایسه با pBR322 فاقد cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفا.....................................................................66

شکل 6-3 : الکتروفورز محصول واکنش PCR بر روی پلاسمیدهای نو­ترکیب بر روی ژل آگارز.........67

شكل 7-3 : نقشه پلاسمید نوترکیب pET21tnf.............................................................68

شکل8-3 : نتایج الکتروفورز محصول PCRپلاسمید نو­ترکیب pETtnf با پرایمرهای R و F بر روی ژل آگارز...................................................................................................................................................69

شکل 9-3 : الکتروفورز محصول پلاسمید نوترکیب pET21tnf برش يافته با آنزیم های NdeI، HindIII و بریده شده با دو آنزیم NdeI- HindIIIبر روی ژل آگارز..............70

شکل10-3 : توالی نوکلئوتیدی ژن TNF و اسیدآمینه­ای ترجمه شده آن از یکی از کلون های نو­ترکیب به دست آمده، pET21tnf...............................................................71

شکل 11-3 : بیان ژن TNF-α انسانی در BL21E. coli.............................................72

شکل 12-3 : مقایسه غلظت­های مختلف IPTG بر روی بیان..........................................73

شکل 13-3 : مقایسه بیان پروتئین در زمان­های مختلف بعد از القاء..................................73

شکل 14-3 : نتایج وسترن بلاتینگ بیان پروتئین نوترکیب در غلظت­های 0625/0، 125/0، 5/0و 1 میلی­مولار..74

 

علايم اختصاري:

LB: Luria Bertani

NK cell: Natural killer cell

OD: Optical Density

TNF: Tumor Necrosis Factors

TAE: Tris-acetate EDTA

SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophoresis

RT-PCR: Reverse transcription polymerase chain reaction

rhTNF-α: Recombinant human Tumor Necrosis Factor alpha

MCS: Multiple cloning site

LPS: Lipopolysaccharide

IPTG: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

IL: Interleukin

INF: Interferon

EDTA: Ethylene diamine tetra acetic acid

DW: Distilled water

APS: Ammonium persulfate

MS: Multiple Sclerosis

TEMED: N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine or N,N,N,N-Tetramethyl-1,2-diaminoethan

TE: Tris EDTA

TM: Melting temperature

RCLB: Red Cell Lysis Buffer

CTL : Cytotoxic T cell

X-gal: bromo-chloro-indolyl-galactopyranoside

MHC: Major Histocompatibility Complex

AD: Alzheimers disease

PD: Parkinsons disease

LT: Lymphotoxin

TLR: Toll-like receptor

FADD: Fas-Associated protein with Death Domain

RIP: Receptor Interacting Protein

 

 

چکیده

سایتوکاین ها خانواده اي از فاكتورهاي رشد هستند که توسط سلول های سيستم ایمنی ترشح می شوند. این خانواده شامل اینترلوکین ها (IL)، اینترفرون ها (IFN)، فاکتور نکروز کننده تومور (TNF)، کموکاین ها و سایر فاکتورهای رشد میباشند. فاکتور نکروز کنندۀ تومور، بعنوان يك مولکولی با خصوصیات آنتی توموری است که عمدتاً توسط ماکروفاژهاي تحريك شده با باکتری ترشح میشود. عليرغم ابنكه مقادير محدودي TNF-α از منابع طبیعی آن بدست مي آيد اما مقادیر زیادی از فرم محلول آن (مورد نیاز برای مطالعات ساختاری و عملکردی) را میتوان به آسانی توسط تکنولوژی DNA نوترکیب به دست آورد. بنابراين ترجیح داده میشود براي توليد اين پروتئین نوترکیب از سیستم های ساده ميكروبي و نيز گیاهان استفاده گردد.

در اينجا به منظور مطالعه بیان TNFα انسانی، cDNA کد کنندۀ hTNFα حاصل از RT-PCR ي mRNA سلول های ماکروفاژ انسان، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی از قبل طراحی شده تکثیر گردید. محصول PCR خالص سازی شده، در سايت برشي EcoRV که در داخل ناحیه کد کننده مقاومت به تتراسایکلین در pBR322 بود، الحاق شد. سرانجام به منظور بيان، ژن هدف در پلاسمیدتحت کنترل سیگنال های رونویسی و ترجمه قوی پروموتور باکتریوفاژT7كلون گرديد به اين ترتيب كه وكتور نوتركيب و نيز هر دو با آنزيم هاي NdeI-HindIII بريده شده و قطعهDNA bp 478 حاصل از برش pBRtnf در pET21a(+) خطي شده، اتصال و سپس در E. coli DH5α ترانسفورم شد. پس از بررسي صحت کلونینگ (توسط تکنیک PCR و آنزیم های برشی) و توالی یابی قطعه کلون شده، بیان سیتوپلاسمی hTNFα نوترکیب در سویه BL21(DE3) E.coliاز طریق تکنیک های SDS-PAGEو نيز وسترن بلاتینگ مورد تاييد قرار گرفت.

 


مقدمه

فاکتور نکروز کننده تومور آلفا (TNF-α) سایتوکایني پیش التهابی است كه در راه اندازی و تنظیم سيستم ايمني ذاتی و پاسخ های التهابی حاد در برابر باکتری های گرم منفی و سایر میکروب هاي بیماری زا از طريق فراخواني نوتروفیلها و منوسیت ها به محل عفونت دخالت دارد. TNF-α براي اولين بار از سرم موش ها و خرگوشهایی که با سویه BCG مایکوباکتریوم بوویس يا آندوتوكسين باكتري ها تيمار شده بودند جداسازي شد كه در مرگ سلول هاي توموري نقش ايفاء مي كرد. اگر چه وجه تسمیه این فاکتور به علت ویژگی های ضد توموری آن است اما اين پلی پپتید 17 کیلودالتونی داراي عملكردهاي متعددي نظير دخالت در آپوپتوزیس، زنده ماندن سلول، التهاب، تنظيم خواب و رشد رويان مي باشد.اين فاكتور غالباً توسط ماکروفاژهای فعال، لنفوسیت هایT ي CD4+، لنفوسیت هایT ي CD8+، سلول های NK و ماست سل ها بيان مي شوند. بیان آن در سلول های دیگر مانند فیبروبلاست ها، سلول های عضلات صاف و سلول های توموری پایین است.

TNF-α نوترکیب امروزه به طور گسترده در تحقیقات علوم پایه و بالینی و نيز به منظور درمان تومور مورد استفاده قرار می گیرد. لذا با توجه به اهمیت آن تولید و تخلیص TNF-α به شکل نوترکیب در موجودات پروكاريوتي در كشور می تواند باعث فراهم شدن زمينه جهت انجام تحقیقات بعدی نظير تحقیقات ملکولی، پزشکی و بالینی بر روی این سایتوکاین مهم باشد. به علاوه امکان تولید آنتی بادی های منوکلونال و پلی کلونال برعلیه TNF-α که امروزه کاربردهای بسیار وسیعی در تشخیص و درمان بیماریهای مختلف دارند نيز فراهم می شود. از سوی دیگر با توجه به نقش ویژه TNF-α در مقابله با تومورهای سرطانی، تولید TNF نوترکیب می تواند دریچه ای نوین در برابر تحقیقات سرطان شناسی و نیز درمان تومورهای سرطانی فراروی محققین کشور بگشاید.

1-1- بیوتکنولوژی پروتئین­های دارویی

بیوتکنولوژی (زیستفناوری)، مجموعه فنونی است که از سیستم زنده برای تولید یا تغییر فرآورده­های زیستی در جهت بهداشت و اقتصاد عمومی استفاده می­کند(Wallman, 1997). گر­چه استفاده از میکروارگانیسم­ها برای تولید فرآورده­های زیستی دارای سابقه طولانی است ولی در زمینه بیوتکنولوژی مدرن امروزینظیر تکنیک­های مهندسی ژنتیک و تکنولوژی DNAنو­ترکیب، کاربرد فراوان دارند. اصطلاح بیوتکنولوژی نخستین بار در سال 1917توسط کارل ارکی[1] به کار برده شد. در سال 1973 هربرت بویر[2] و استنلی کوهن[3] تکنولوژی DNA نو­ترکیب را ارایه دادند و در سال 1976 اولين شركت مستقل بيوتكنولوژي،­Genentech، به منظور تجاري كردن اين تكنولوژي جديد تاسيس شد. در سال 1982 انسولین انسانی نو­ترکیب با استفاده از تكنولوژي DNA نوتركيب براي نخستين بار در E. coli به مرحله تولید رسید(Mckown and Coffman, 2002).پیش از بکار بردن روشهای بیوتکنولوژی، تنها منبع تولید پروتئین­های دارویی منابع طبیعی آنها نظیر خون و بافت­های انسانی و حیوانی بود که اغلب به میزان بسیار اندک و با صرف هزینه بسیار بالا تهیه می­شد. همچنین به دلیل مشکل بودن روشهای خالص سازی و از طرفی آلرژی­زا بودن پروتئین­های حیوانی برای انسان و امکان بروز اثرات جانبی، استفاده از این ترکیبات را محدود می­نمود(Brown, 2001). امروزه تکنولوژی DNA نو­ترکیب امکان آن را فراهم کرده است که بتوان cDNA کد کننده هر پروتئین را جدا کرده و به یک سیستم بیان کننده مناسب وارد کرد. در این حالت پروتئین مورد نظر در موجود بیگانه که اغلب یک میکروارگانیسم است،

 

 

بیان می­شود(Glick and Eds, 1998). به این ترتیب می­توان پروتئین­های دارویی را در مقیاس انبوه و بسیار ارزان­تر از روش­های قبلی تولید نمود(Walsh and Headon, 1994).

در حال حاضر بیش از 100 پروتئین دارویی نو­ترکیب برای درمان بیماری­های انسانی در بازار وجود دارد و در حدود 400 داروی جدید در درمان بیماری­های مختلف به ویژه سرطان، ایدز و ناراحتی­های دستگاه عصبی در مراحل کار آزمایی بالینی قرار دارند(Mckown and Coffman, 2002).

تکنولوژی دارویی مدرن از کلون کردن ژن و تکنولوژی DNA نوترکيب بهره می­گيرد. هدف نهايی بيوتکنولوژی دارويی ژن درمانی و ورود مواد ژنتيکی به سلول­ها برای جلوگيری يا کنترل و يا معالجه بيماری می­باشد(Ossege, Sindern et al., 1998). جدول 1-1 برخی از پروتئین­های دارویی تولید شده به صورت نو­ترکیب (T. A. Brown) را نشان می­دهد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 1-1: برخی از پروتئین­های نو­ترکیب موجود در بازار دارویی (T. A. Brown)

Used in the treatment of

Protein

Diabetes

Insulin

Growth disorders

Somatostatin

Growth disorders

Somatrotropin

Haemophilia

Factor VIII

Christmas disease

Factor IX

Leukamia and other cancers

Interferon-α

Cancers, AIDS

Interferon-β

Cancers, rheumatoid arthritis

Interferon-γ

Cancers, immune disorders

Interleukins

Cancers

Granulocyte colony stimulating factor

Cancers

Tumour necrosis factor

Ulcers

Epidermal growth factor

Ulcers

Fibroblast growth factor

Anaemia

Erythropoietin

Heart attack

Tissue plasminogen activator

Free radical damage in kidney transplants

Suproxide dismutase

Respiratory distress

Lung surfactant protein

Emphysema

1-antitrypsinα

Used as a plasma supplement

Serum albumin

Used to aid childbirth

Relaxin

 

1-2- کلون کردن ژن

كلون كردن عبارت است از به وجود آوردن نسخهکاملاً مشابه يك قسمتكوچكي از DNA، سلول و يا موجود كامل. كلون كردن ژن تحت عناوين كلون كردن مولكولي و تكنولوژيDNA نو­تركيب نيز شناخته مي­شود(Brown 1996). در این تکنیک يك توالي ژني را جدا كرده و با آنزیم اختصاصی برش می­دهند. سپس با استفاده از آنزیمDNA لیگاز[4]DNA مورد نظر در يك وكتور مناسب قرار داده می­شود. هیبرید حاصله را ConstructDNA گویند. که با انتقال به باکتری و یا سلول میزبان امکان تکثیر آن فراهم می­شود(Maeyer and De Maeyer-Guignard, 1998). در سال 1973، نخستین DNA نو­ترکیب با استفاده از آنزیم­های برشی و آنزیم لیگاز در دانشگاه Stanford آمریکا ساخته شد.

کشف تکنولوژی DNA نو­ترکیب سر­آغاز پیشرفت­های جدید در علوم و بیوتکنولوژی شد. یکی از خصوصیات مهم ژن کلون شده در تکنولوژی DNA نو­ترکیب، این است که اغلب می­تواند درون موجودی دیگر که کاملاً متفاوت با موجود اولیه است، فعالیت خود را انجام دهد(Michael and et., 1982). اهميت اصلي كلون كردن ژن به دست آوردن مقادير كافي از ژن­هاي مورد نظر براي تجزيه و تحليل بعدي است و امكان آزمايشات ژنتيكي براي فهم مكانيسم­هاي دخيل در بيماري­هاي ژنتيكي و در نتيجه پيدا كردن راهكارهاي مناسب براي تشخيص و درمان آنها را فراهم مي­آورد. كلون كردن ژن همچنين در داروسازي امروزه براي ساخت داروها با ساختار پروتئين نقش اساسي دارد. در حال حاضر یکی از مهمترین راهکارهای استفادة درمانی از این فناوری در توسعة روش­های درمانی نوین از جمله ژن درمانی است.

1-2-1- ابزار و عوامل کلون کردن ژن

همانطور که قبلاً ذکر شد اساس کلون کردن، برش دادن مولکول­های متفاوت DNA و اتصال دوبارة آنها است. برای این کار ابزارهای مولکولی لازم است که مهمترین آنها آنزیم­های محدود کننده[5] و آنزیم لیگاز هستند.

1-1-2-1- آنزیم­های برشی

در كلون كردن ژن، براي ايجاد يك مولكول DNAي نو­تركيب، ناقل بايستي به صورت کاملاً دقیق در يك نقطه مشخص(با امكان اتصال و برش دوباره) برش داده شود تا قطعه DNA كه قرار است، کلون

 

شود، در آن نقطه وارد گردد. اندونوكلئاز­هاي برشي، آنزيم­هايي هستند كه قطعه DNA را در مكان­هاي اختصاصي برش مي­دهند. اولين آنزيم برشي در سال 1970 از باكتري Haemophilus influenzaeجداسازي شد. انواع مختلف باکتری­ها انواع متفاوتی از این آنزیم­ها را تولید می­کنند. به همین دلیل اسامی آنها معمولاً از نام باکتری­های مولد آنها مشتق شده است(McDonald, 1996).

2-1-2-1- آنزيم DNA لیگاز

يكي از آنزيم­هاي مهم در سلول براي اتصال قطعات، DNA ليگاز ناميده مي­شود که موجب بازسازی پیوندهای فسفودی­استری از هم گسیخته می­گردد. هر گاه DNAي ناقل و DNAي خارجي هر دو با يك آنزيم برشي بريده شوند، نواحي انتهايي متناظر در ناقل و DNAي خارجي با يكديگر سازگار بوده و مكمل يكديگرند. و توالي­هاي تك رشته­اي انتهاهاي مكمل با هم جفت مي­شوند. ليگاز­ها روي قطعات برخوردار از گروه فسفات در انتهاي 5 عمل كرده و با ايجاد پيوند فسفودی­استری سبب بر­قراري اتصال بين دو توالي DNA مي­شوند، اين فرايند كه به اتصال[6] معروف است، آخرين مرحله ساخته شدن يك مولكول DNAي نو­تركيب است.

در کلون کردن ژن­ها نوع آنزيمي كه معمولاً مورد استفاده قرار مي­گيرد، DNA ليگاز T4 است كه از باكتري­هاي E. coliآلوده شده با باكتريوفاژ T4 به دست مي­آيد. زيرا اين آنزيم هم قادر به اتصال رشته هاي DNAي دو رشته­اي با انتهاي صاف و هم با انتهاي چسبان مي­باشد در حالي كه DNA ليگاز باكتري E. coli در اتصال قطعات با انتهاي صاف ناتوان است. دماي بهينه فعاليت هر دو آنزيم در سيستم بيولوژيكي 37 درجه است. ولي از آنجا كه براي اتصال قطعات جدا از هم و مكمل تشكيل اوليه

 

 

پيوندهاي هيدروژني بين نوكلئوتيدهاي مكمل ضروري است و در واكنش درون شيشه­اي[7] پيوندهاي هيدروژني، پايداري چنداني در مقابل دماي بالا ندارند به همين دليل اين نوع واكنش­ها در دماهاي پايين 16-4 درجه سانتيگراد و به مدت طولاني انجام شود(McDonald, 1996).

2-2-1- وکتورهای کلونینگ

براي اين كه بتوان قطعه­اي از DNAي دلخواه (موسوم به Insert DNA) را با استفاده از شرايط طبيعي (in vitro) تكثير كرده و براي مطالعات بيشتر استفاده نمود، لازم است DNA را توسط مولكول­هاي وکتور به سلول­هاي مورد نظر انتقال داد. در غير اين صورت، عمل انتقال، تكثير و يا استخراج DNAي مورد نظر امكان­پذير نمي­شود. نظر به اين كه قطعات تكثير شده همه با هم يكسان هستند، اين نوع متدولوژي به همسانه­سازي DNA موسوم است. مولكول­هاي وکتور DNA(DNAVector) كه خود DNA مي­باشند، بنا به داشتن توالي به خصوصي قادر هستند در سلول­هاي ميزبان خود به تعداد زيادي تكثير شوند. در اين صورت قطعه DNAي دلخواه نيز به همراه وکتور خود تكثير مي­شود.

وكتورهاي DNA تنوع بسيار زيادي دارند. مهمترين عامل طبقه­بندي آنها ميزان ظرفيت حمل DNA به سلول ميزبان است. قطعات DNA را مي­توان از چند نوكلئوتيد گرفته تا بيش از صد هزار نوكلئوتيد توسط وكتورهاي مناسب همسانه­سازي نمود. به همين دليل در طراحي اوليه بايد ابتدا اندازه DNAي مورد نظر را مشخص و وكتور مناسبي انتخاب نمود. پلاسمیدها، فاژλ، کاسمید و کروموزوم­های مصنوعی مخمر(Yeast artification chromosom) از وکتورهایی هستند که بیش از سایر وکتورها مورد استفاده قرار می­گیرد(Larry and Champness, 2007).

 

 

مشخصات كلي وكتورهاي كلونينگ

وكتورهاي مختلف DNA با تنوع بسيار زياد، شامل اندازه­ها و ظرفيت­هاي حمل مختلف موجود مي باشند، ولي داراي نقاط مشترك اساسي ذيل هستند:

· مبدا همانند­سازي[8]

همهوكتورها داراي توالي­هاي ويژه­اي هستند كه توسط آنزيم DNA پلي­مراز سلول ميزبان شناسايي شده و به تعداد بسيار زيادتر از ژنوم خود ميزبان تكثير مي­شوند اين توالي به مبدا همانند­سازي موسوم است وبا Ori نشان داده مي­شود. برخي وکتورها حاوي دو نوع Ori براي تكثير در دو نوع سلول ميزبان مي باشند. همانند­سازي وكتور توسط DNA پلي­مراز سلول ميزبان، در اين ناحيه شروع و در دو جهت (Bi-directional) مخالف هم ادامه مي­يابد.

  • نشانگرهای انتخابی[9]

همه وكتورها حامل ژن­هايي هستند كه به واسطه ايفايش آنها مي­توان وجود وكتور را به سهولت در داخل سلول ميزبان رديابي نمود. متداول­ترين نشانگرها، ژن­هايي هستند كه فرآورده آنها باعث بروز مقاومت در برابر آنتي­بيوتيك­هاي به خصوصي مي­شود. در صورتي كه وكتور به داخل سلول ميزبان حساس به يك آنتي­بيوتيك انتقال يابد، مي­تواند در حضور همان آنتي­بيوتيك زنده مانده و رشد كند. انواع نشانگرهاي رايجي كه مقاومت به آنتي­بيوتيك به خصوصي را در سلول ميزبان القاء مي­كنند، آمپي سيلين[10]، تتراسايكلين[11]، جنتامايسين[12]، كانامايسين[13] و استرپتومايسين[14] مي­باشند.

 

 

  • نشانگرهای ژنتیکی[15]

دسته ديگري از نشانگرها، ژن­هايي هستند كه عامل كنترل يك سري واكنش­هاي بيوشيميايي هستند. و در حضور مواد زمينه خاصي واكنش­هاي به خصوصي را بر­مي­انگيزند. مثلاً ژن LacZ كه استفاده از آن بسيار متداول مي­باشد در صورت انتقال به سويه­اي از باكتري E. coli كه اين ژن را ندارد باعث توليد آنزيم بتا-گالاكتوزيداز مي­شود كه مي­تواند روي ماده­اي بنام X-Gal اثر کرده و رنگ آبي در محيط اطراف سلول توليد کند. براي تشخيص اينكه سلول ميزبان حاوي وکتور DNA است، استفاده از يك نوع نشانگر كافي است ولي براي اينكه بتوان ماهيت وکتور را در رابطه با حامل بودن DNA وارد شده بررسي نمود، استفاده از نشانگرهاي ثانوي ضروري می­باشد.

  • جایگاه کلونینگ متعدد[16] (MCS)

براي اينكه بتوان DNA وارد شده را با استفاده از مكانيسم نوتركيبي[17] وارد قسمت خاصي از DNAي وکتور کرد، در ساده­ترين روش كار لازم است با استفاده از آنزيم­هاي برش دهنده هر دو DNA را برش داده و قطعات برشي و سپس دو نوع DNA را به هم اتصال داد در وکتورهاي جديد جايگاه کلونینگ يا MCS شامل توالي­هايي است كه حاوي توالي­هاي شناسايي و جايگاه برش براي آنزيم­هاي برش دهنده متعدد مي­باشد. در کلونینگ بايد از آنزيم­هايي استفاده كرد كه فقط مي­توانند يكبار DNA وکتور را مورد برش قرار دهند به همين دليل اين جايگاه­ها را جايگاه برشي منحصربه فرد مي­نامند. بنابر اين MCS هر وکتور جايگاه برشي آنزيم­هايي را ارائه مي­كند كه در تمامي طول وکتور منحصر به فرد[18]هستند. اگر­چه وجود MCS در يك وکتور الزامي است اما اين جايگاه بايد در مكان ويژه­اي در روي وکتور قرار گرفته باشد به طور رايج اين محل در ناحيه ´5 ژن LacZ قرار دارد كه وجود آن در اين محل در توليد فرآورده اين نشانگر اختلالي ايجاد نمي­كند در صورت وارد كردن DNA در جايگاه MCS توالي اين ژن مختل شده و عدم توليد كلوني­هاي آبي رنگ در حضور X-Gal وجود DNAي وارد شده را نشان مي­دهد.

  • جایگاه­های پروموتر[19]

بسته به هدف کلونینگ، وكتورهاي متفاوتي طراحي شده­اند و به منظور انجام عمليات مختلف، توالی­هاي ويژه­اي در يك يا دو رديف MCS قرار داده شده­اند. اين توالی­هاي اليگو­نوكلئوتيدي محل شناسايي و كنترل آنزيم­هاي مختلف از منابع متفاوت هستند كه در سويه­هاي مختلفE. coli موجود مي­باشند. به اين ترتيب بايستي براي اهداف و عمليات بخصوص، وكتور و سويه باكتري مناسب و سازگاري را انتخاب نمود. ممكن است هدف از کلونینگ توليد و تكثير DNA هدف، توليدmRNA از DNAي هدف يا اين كه توليد فرآورده پروتئيني کد شونده از DNAي هدف باشد. وجود پروموترهاي ويژه و آنزيم­هاي مربوطه انجام اين نوع عمليات را بر­عهده دارند.

Expression Vector

 



جهت کپی مطلب از ctrl+A استفاده نمایید نماید



p><!--EndFragment

  انتشار : ۱۱ مهر ۱۳۹۶               تعداد بازدید : 241

برچسب های مهم

دیدگاه های کاربران (0)

کسب درآمد اینترنتی 300000 تومان در خانه در کمتر از 30

کسب درآمد اینترنتی 300000 تومان در خانه در کمتر از 30

این محصول آپدیت شد تاریخ 1397/01/27 بسم الله الرحمن الرحیم سلام در دنیای اینترنت خیلی از آدم ها هستند که دوست دارند کسب درآمد کنند و به خیلی چیزها و ایده ها فکر میکنند . همه ما دوست داریم در کمترین زمان بهترین درآمد را داشته باشیم مثلا یک فرد به طور میانگین اگر 12 ساعت کارکند و ...

کسب درامداز اینترنت ماهیانه 8میلیون تومان

کسب درامداز اینترنت ماهیانه 8میلیون تومان

پکیج کسب درآمداسان از اینترنت اپدیت جدید 15 اردیبهشت 1397 مناسب برای تمامی افرادباهرسن ودانشی این فرصت هرگز تکرار نمیشود عجله کنید تضمین100%بازگشت وجه درصورت عدم کسب این مبلغ هدیه ویژه پس از خرید این محصول: 1.نرم افزار کی به وای فای وصله نرم افزاری برای ...

کسب درآمد 300هزار تومان در 60دقیقه

کسب درآمد 300هزار تومان در 60دقیقه

کسب درآمد 300/000تومان در 60 دقیقه فقط کافیست 5دقیقه متن زیر را بخوانید تا با ارزش میلیونی این پکیج آشناشوید. اولین پکیج 100% تضمینی اشتغازایی در ایران با این پکیج استثنایی که میلیونی ارزش دارد، شما میتوانید به صورت کاملا تضمینی از شر بیکاری خلاص شوید. و ما به شما قول میدهیم ...

کتاب اعجاب انگیز افزایش سایز آلت تناسلی|مسائل

در اين سايت روشي را به شما معرفي مي كنيم براي بزرگ كردن آلت تناسلي كه نتايج فوق العاده اي براي شما در بر خواهد داشت،كه خودتان هم باور نمي كنيد: . . . 1-افزايش طول و ضخامت به اندازه 3cm الي 8cm 2-افزايش طول تا بيش از50%اندازه فعلي در حالت راست وسفت ...

دانلود کتاب نایاب مادرکافی جوفراست در مورد

دانلود کتاب نایاب مادرکافی جوفراست در مورد

مادر احسان از دستش کلافه شده است. احسان ۱۰ سال دارد و در کلاس چهارم ابتدایی تحصیل می‌کند. او گاهی اوقات رفتارهای بد و پرخاشگرانه‌ای از خود نشان می‌دهد. احسان وقتی عصبانی می‌شود همه چیز را به هم می‌ریزد؛ از کوسن‌های مبل که به اطراف پرتاب می‌شود بگیرید تا کاغذ ...

تماس و پیامک ناشناس و رایگان با شماره

تماس و پیامک ناشناس و رایگان با شماره

برنامه تماس و ارسال پیام رایگان به دیگران با شماره ناشناس به صورت کاملا رایگان بدون نیاز به روت به وسیله این برنامه میتوانید با شماره دلخواه خود به دیگران زنگ بزنید. یعنی زمانی که شما با دیگران تماس می گیرید شماره دلخواهی که شما در برنامه وارد کرده اید برای شخصی که ...

مستند جدید و جنجالی تن فروشی

مستند جدید و جنجالی تن فروشی

جنجالی ترین و جدید ترین فیلم تاریخ جنسی ایران مستند جدید تن فروشی این فیلم ۱۰۰ درصد مورد نیاز شماست خلاصه فیلم ما امروز در ابتدای مسیری هستیم که غرب از ۲۰۰ سال پیش در راه آزادی‌های جنسی طی کرده‌است. مستند انقلاب جنسی، آزادی‌های جنسی در ایران را نمایش می‌دهد و ...

آموزش کامل تله کینزی در دو روز

آموزش کامل تله کینزی در دو روز

فقط در 2 روز...! با سلام. در این کتاب آموزش کامل تله کینزی را بصورت خیلی ساده و روان در اختیار شما قرار دادیم که هرکسی حتی در مبتدی ترین سطح میتواند تله کینزی را در کمترین زمان ممکن یاد بگیرد. آموزش هایی که داده شده همراه با تصویر میباشند و باعث یاد گیری بهتر شما عزیزان ...

کسب درآمد در هر 3 دقیقه 5000 تومان

کسب درآمد در هر 3 دقیقه 5000 تومان

برای اینکه از همین امروز صاحب کسب و کار میلیونی شوید کافی است فقط چند دقیقه وقت بگذارید و توضیحات زیر را بخوانید. کسب درآمد میلیونی بدون نیاز به اینترنت شما توسط این پکیج می توانید در هر سه دقیقه ۵ هزار تومان درآمد کسب کنید. اگر شما فرد بیکاری هستید ؟ اگر ...

کسب درآمد 650میلیون تومانی در یک روز کاملا تست

کسب درآمد 650میلیون تومانی در یک روز کاملا تست

این روزها با توجه به شرایط نامناسب اقتصادی کشور، کسب درآمد برای خیلی از افراد جامعه بسیار دشوار است. بسیاری از افراد به امید اینکه در آینده بتوانند یک شغل کارمندی داشته باشند به سختی درس می خوانند و عده ای دیگر که نتوانند درس بخوانند نیز راه های دیگری را انتخاب می کنند. ...

کتاب « الفبای جامع ثروت و ثروتمندشدن » برای

کتاب « الفبای جامع ثروت و ثروتمندشدن » برای

قوانین ثروتمند شدن چیست؟ ذهن ثروتمندان چگونه کار می کند؟ وجود ثروت ساز چگونه وجودی است؟ چرا بعضی افراد با اینکه سخت کار می کنند هیچ وقت پولدار نمیشوند؟ ذهن فقرا با ذهن ثروتمندان چه تفاوتی دارد؟ نوع مشاغل ثروتمند شدن شما کدام است؟ چرا اکثر مردم از پیشرفت و بهبود ...

دانلود بسته آموزشی تقویت هوش جنین

دانلود بسته آموزشی تقویت هوش جنین

تقویت هوش جنین!!!!!!!!!!!! امروز برای شما همراهان همیشکی نسیم بوک کتابی در رابطه با اجرای تکنیکهای موفق دنیا در مورد تضمین سلامت روان،تقویت هوش جنین و زیبایی چهره آماده کرده ایم که در ادامه میتوانید دانلود کنید.... مطابق با آخرین یافته های دانشمندان بزرگ دنیااز جمله پروفسور ...

اد ممبر بینهایت ( افزایش ممبر(اعضای) کانال،ربات و

اد ممبر بینهایت ( افزایش ممبر(اعضای) کانال،ربات و

-اد ممبر بینهایت- {افزایش ممبر(اعضای) کانال،ربات و گروه تلگرام و...} Addmember نسخه ویژه(VIP) تمامی و کامل ترین نرم افزار های افزایش ممبر واقعی و فیک و آموزش های آن، که در اینترنت و بازار به قیمت های بالا به فروش می رسد را یک جا و مرتب و منظم به همراه راهنما در هر بخش، با قیمتی کم در ...

مجموعه -صفر تا صد راه اندازی کارگاه جوراب

نام محصول: مجموعه صفرتاصد راه اندازی کارگاه جوراب بافی تهیه کننده: دوران راهبی انتشار: وبسایت بچه‌های نساجی دانشگاه یزد فرمت محصول: کتاب الکترونیکی(PDF) + ویدئو MP4 قابل پخش در: موبایل، تبلت، کامپیوتر و ... مخاطب این بسته آموزشی: تمام افراد مبتدی که حداقل سرمایه ...

تمامی نرم افزار های اددممبر واقعی و فیک

تمامی نرم افزار های اددممبر واقعی و فیک

تمامی و کامل ترین نرم افزار های افزایش ممبر واقعی وفیک را یک جادریافت کنیدهرکدام از این نرم افزار ها در اینترنت و کافه بازاربه قیمت خیلی بالایی بفروش میرسند. نکته: پورسانت بازاریابی این محصول 60% است نسخه ی 100%تست شده با توجه به فیلترینگ تلگرام 15 اردیبهشت ...

خلاصه کتاب وسؤالات تستي کتاب تفسیر قرآن کریم -

خلاصه کتاب وسؤالات تستي کتاب تفسیر قرآن کریم -

مجموعه سؤالات تستي كتاب تفسیر قرآن کریم (آیات برگزیده) (ويراست دوم، نشر معارف) مشتمل بر 600 سؤال. 2 جزوه و خلاصه درس (تفسیر قرآن کریم(آیات برگزیده) فایل pdfکتاب حجم فایل:20kb گردآورنده این فایل وب سایت نسیم بوک ...

دانلود کتاب الگوهای شمعی ژاپنی استیو نیسون

دانلود کتاب الگوهای شمعی ژاپنی استیو نیسون

راهنمای معاصر از شیوه سرمایه گذاری کهن شرق دور آیا مایلید سیستمی در تحلیل تکنیکال را که عصاره قرن‌ها کار مداوم است بیاموزید؟ سیستمی که انعطاف‌پذیری آن به حدی است که می‌توان آنرا با سایر ابزارهای تحلیل تکنیکال آمیخت؟ سیستمی قدرتمند که استفاده از آن، لذت وافری را به ...

جزوه انتگرال مهندس امیر مسعودی

جزوه انتگرال مهندس امیر مسعودی

جزوه انتگرال و سری مسعودی که شما را در کوتاه ترین زمان‌ ممکن و بی نیاز از مشاهده مستقیم dvd های پر حجم و زمان بر استاد به تسلط 100% در این مبحث میرسونه!!!!!! برای اولین بار و تنها در ijozve این مبحث را با تخفیف ویژه 50% و به صورت کاملا اورجینال تهیه کرده و از ان لذت ...

افزایش قد با متد گرو تالر داینامیک

افزایش قد با متد گرو تالر داینامیک

بلند قامت بودن یک امتیاز بزرگ برای شماست! سلام بیتا بیات هستم کارشناس فیزیولوژی ورزشی،لازم دانستم قبل از این که شما با روش گرو تالر داینامیک آشنا شوید چند تا نکته رو صادقانه خدمتتان عرض کنم همانطور که تو اینستاگرام(khosh.andam@)نوشتم خیلی اتفاقی با این متد آشنا ...

دانلود تمامی محصولات عباس منش

دانلود تمامی محصولات عباس منش

دانلود تمامی محصولات عباس منش شما میتوانید با خرید این پکیج تمام آموزش های عباس منش رو دریافت کنید. محصولات موجود در پکیچ : دانلود رایکان دوره چگونه هدف گذاری کنیم و به آن برسیم دانلود رایگان قانون آفرینش استاد عباس منش دانلود رایگان دوره تندخوانی، تقویت حافظه و شیوه ...

افزایش لایک بینهایت اینستاگرام

افزایش لایک بینهایت اینستاگرام

نرم افزار افزایش لایک بینهایت اینستاگرام – بدون هزینه اضافی امروز برای شما دوستان نرم افزار افزایش لایک بینهایت اینستاگرام که کاربرد بسیار فوق العاده عالی رو داره در اختیارتون قرار دادیم با کمک این برنامه شما در عرض یک ساعت تبدیل به فروشنده لایک اینستاگرام میشوید این ...

دانلود کتاب آموزش ساخت انواع کابینت مدرن MDF

دانلود کتاب آموزش ساخت انواع کابینت مدرن MDF

نوع فایل:PDF زبان:فارسی حجم فایل:18KB در چند دهه اخیر با توجه به افزایش رشد آپارتمان سازی ، تعداد متقاضیان ساخت کابینت نیز افزایش پیدا کرد و با توجه به تغییر ماهیت کابینت ها از فلزی به MDF و تمایل به تغییر مکرر دکوراسیون آشپزخانه از سوی خانواده ها ، کابینت سازی نیز در میان مشاغل ...

دانلود نمونه سوالات سیستم سوخت رسانی انژکتور

دانلود نمونه سوالات سیستم سوخت رسانی انژکتور

این پکیج مناسب افرادی است که میخواهن در آزمون های ادواری شرکت کنند و قبولی خود را تضمین کنند محتوای پکیج: عنـوان رشته : سیستم سوخت رسانی انژکتور پراید سری اول135:بدون جواب سری دوم30:با جواب فرمت فایل:pdf تعداد سوالات:165 ...

جزوه های دروس مهندس عمران

جزوه های دروس مهندس عمران

جزوه های دروس مهندس عمران این مجموعه شامل جزوات زیر است : جزوه بارگذاریجزوه بتن 1 و 2جزوه دیفرانسیلجزوه راهسازیجزوه زبان تخصصیجزوه کامل ریاضیات مهندسی 1 و 2جزوه سد های خاکی جزوه سیالاتجزوه استاتیک جزوه بازرسی جوشجزوه تاسیسات مکانیکی و برقیجزوه تحلیل سازه ها - روش اجزاء ...

دانلود نمونه سوالات فرزکاری درجه 2

دانلود نمونه سوالات فرزکاری درجه 2

این بسته پیشنهادی که توسط سایت نسیم بوک جمع آوری شده شامل: 380نمونه سوال تستی باجواب نام محصول: دانلود نمونه سوالات فرزکاری درجه 2 تعداد مجموع سوالات: 380نمونه سوال با جواب قابل استفاده برای مهارت آموزان،دانش آموزان ،متقاضیان آزمون های ادواری و مربیان ...

دانلود پرسشنامه اعتیاد به کار اسپنس و رابینز

دانلود پرسشنامه اعتیاد به کار اسپنس و رابینز

پرسشنامه اعتیاد به کار ( اسپنس و رابینز، 1992) روایی و پایایی دارد منبع معتبر دارد پرسشنامه استاندارد دارد نمونه منبع فارسی دارد تعداد سوالات:10 سوال با طیف لیکرت ابعاد:عجین شدن با کار،تعامل درونی در کار،لذت از کار فایل:word دسته بندی:پرسشنامه رفتار سازمان،پرسشنامه منابع ...

دانلود نرم افزاربرنامه ساز طلایی اندروید +آموزش

دانلود نرم افزاربرنامه ساز طلایی اندروید +آموزش

دانلود برنامه ساز طلایی اندروید نسخه PRO بیش از 100دانلود تا حالا و با رضایت 100% تماس های زیادی در مورد آموزش استفاده از این نرم افزار را داشتیم با توجه، بر آن شدیم تا طریقه استفاده از این نرم افزار و گذاشتن آن در مارکت اندروید را کاملا تصویری و جزء به جزء برای شما آموزش دهیم ...

نسخه خطی اشعار و پیشگویی های شاه نعمت الله ولی

نسخه خطی اشعار و پیشگویی های شاه نعمت الله ولی

شاه نعمت‌الله ولی نسخه خطی اشعار و پیشگویی های شاه نعمت الله ولی پر فروشترین کتاب نسخه خطی با بیش از 2000000 فروش تا کنون به دليل استقبال بي نظيز شما كاربران گرامي نسخه خطي فوق فقط تا پايان اسفند ماه با 20% تخفيف به فروش مي رسد و بعد از آن به قیمت ...

خلاصه و نکات مهم مدنی 1تا 8 کاتوزیان

خلاصه و نکات مهم مدنی 1 تا 8 , جزوه مدنی 1تا 8 کاتوزیان , تمام نکات مهم حقوق مدنی , در این بخش خلاصه و نکات مهم حقوق مدنی 1 تا 8 دکتر کاتوزیان رابرای دانلود و استفاده شما عزیزان قرار دادیم با تخفیف ویژه ...

دانلود خلاصه کتاب مدیریت تحول اداری سازمان مسعود

دانلود خلاصه کتاب مدیریت تحول اداری سازمان مسعود

در این بخش خلاصه کامل کتاب مدیریت تحول اداری سازمان با رویکرد پژوهشی به نظام اداری ایران تالیف مسعود احمدی را با فرمت PDF در 58 صفحه با کیفیت عالی مخصوص دانشجویان ارشد دانشگاه پیام نور آماده دانلود کرده ایم،در صورت نیاز می توانید این فایل را از فروشگاه خریداری و دانلود ...

اعتبار ما اعتماد شما

فید خبر خوان    نقشه سایت    تماس با ما