بیتوته پرتابل جامع شامل ،کسب درآمد،و مقالات دانشگاهی

بهترین ها ی اینترنت را از سایت ما دانلود کنید با ضمانت هفت ستاره

اشتراک در خبرنامه

جهت عضویت در خبرنامه لطفا ایمیل خود را ثبت نمائید

Captcha

آمار بازدید

  • بازدید امروز : 122
  • بازدید دیروز : 132
  • بازدید کل : 113587

پیوند ها

كلون و بيان فاكتور نكروز دهنده تومور آلفا (TNF-α)


كلون و بيان فاكتور نكروز دهنده تومور آلفا (TNF-α)

p><!--StartFragment

 


چکیده

 

مقدمه

علایم اختصاری

 

فصل اول: بررسی منابع

 

1-1- بیوتکنولوژی پروتئین­های دارویی

1

2-1- کلون­کردن ژن

3

1-2-1- ابزار و عوامل کلون­کردن ژن

4

1-1-2-1- آنزیم­های برشی

4

2-1-2-1- آنزيم DNA لیگاز

5

2-2-1- وکتورهای کلونینگ

6

1-2-2-1- پلاسمیدها

10

3-1- سیستم­های بیان کننده مورد استفاده در تولید پروتئین­های نو­ترکیب

11

1-3-1- باکتری E. coliبعنوان میزبان بيان کنندة پروتئین­های نو­ترکیب

15

2-3-1- وكتور بيان­كننده

15

1-2-3-1- پروموتر

16

1-1-2-3-1- پروموتر T7 و سیستم بیانی PET

17

2-2-3-1- منشاء همانند­سازی

18

3-2-3-1- ماركر انتخابي

18

4-2-3-1- خاتمه دهنده رونويسي

19

5-2-3-1- سيگنالهاي ترجمه يكي از عوامل مؤثر در افزايش بيان

19

6-2-3-1- انتخاب كدون

20

4-1- مسائلي در مورد توليد پروتئين­هاي نو­ترکيب در اشرشياکلي

21

1-4-1- پايداري پلاسميد

21

2-4-1- عدم حذف متيونين در انتهاي N ترمينال پروتئين نو­ترکيب

22

3-4-1- بار متابوليکي

23

4-4-1- مشکلات بيان پروتئين­هاي نوترکيب در سيتوپلاسم باکتري اشرشياکلی.

23

5-1- سيستم ایمنی ذاتی و اكتسابي

25

6-1- سایتوکاین­ها

25

1-6-1- فاکتور نکروز کننده تومور (TNF)

26

1-1-6-1- ويژگي­هاي ژن و مولكول TNFα

27

2-1-6-1- ويژگي هاي ساختاري پروتئين TNF

28

3-1-6-1- ساختار گیرنده TNF و سوپرفاميلي آنها

29

4-1-6-1- نقش بيولوژيكي TNFα

31

5-1-6-1- مكانيسم عمل

31

7-1- TNF-α و نقش آن در برخي از بيماري­های تحلیل عصبي

34

1-7-1- TNF و بیماری آلزایمر(AD)

34

2-7-1- TNF و ایسکمی مغزي

35

3-7-1- TNF و بیماری پارکینسون

36

دستگاه­هاي مورد استفاده

 

فصل دوم : مواد و روش­ها

 

1-2- نمونه­گيري از خون انسان

38

2-2- استخراج ­RNAي كل از خون

38

1-2-2- وسايل لازم

38

2-2-2- روش کار

39

3-2- سنتز cDNA

40

1-3-2- روش کار

41

4-2- کلونینگ cDNA­ ی کد کننده TNF-α­ی انسان

41

1-4-2- طراحی جفت پرایمرها

41

2-4-2- واکنش PCR

42

1-2-4-2- الكتروفورز با ژل آگاروز

43

1-1-2-4-2- مواد و وسایل مورد نیاز

43

2-1-2-4-2- روش کار

43

3-1-2-4-2- رنگ­آميزي ژل آگارز با اتيديوم برومايد

43

3-4-2- خالص­سازی محصول PCR با استفاده از كيت

44

4-4-2- کلونینگ cDNA کد کننده TNF-α در وکتور pBR322

45

1-4-4-2- انجام واکنش اتصال

47

2-4-4-2- ترانسفورماسیون محصول اتصال به باکتری

47

3-4-4-2- میزبان باکتریایی E. coli

47

4-4-4-2- کشت و نگهداری باکتری­ها

48

5-4-4-2- تهيه باكتريهاي مستعد (Competent bacteria)

براي پذيرش DNA پلاسميديخارجي

 

49

6-4-4-2- انتقال پلاسمید به درون سلول­های مستعد باکتریایی

50

7-4-4-2- غربال كردن كلون‌هاي واجد پلاسميد نو­تركيب و کشت کلونی باکتریایي.

50

8-4-4-2- استخراج DNA پلاسميدينو­ترکیب

51

9-4-4-2- تایید کلنی­های حاوی اینسرت توسط PCR و آنزیم­های برشی

51

5-4-2- كلونينگ cDN­ی كد­كننده TNF-α در حامل pET21

52

1-5-4-2- برش حامل pET21

52

2-5-4-2- اتصال ­cDNAی TNF-α به حامل pET21

54

6-4-2- انتقال پلاسمید نوترکیب به باكتريE.coli سویهBL21(DH3) برای بررسی
پروتئین نوترکیب

54

1-6-4-2- انتخاب کلون­هاي ترانسفورم شده و کشت کلنی­ها

54

5-2- روش­های مربوط به بررسی بیان پروتئین hTNFα نو­ترکیب

55

1-5-2- القاء بیان پروتئین نو­ترکیب

55

2-5-2- تهیه نمونه پروتئینی جهت SDS-PAGE

55

1-2-5-2- SDS-PAGE

56

2-2-5-2- مواد لازم جهت SDS-PAGE

57

3-2-5-2- روش آزمایش

57

3-5-2- وسترن بلاتينگ

59

6-2- نرم­افزارها

61

فصل سوم : نتایج

 

1-3- نمونه­های خون

62

2-3- استخراج RNA کل از خون

62

3-3- سنتز cDNA كل

63

1-3-3- تکثیر توالی کد­کننده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای انسانی

63

4-3- کلون­سازی توالی کد کننده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای انسانی تکثیر شده با روش PCR در پلاسمید pBR322 و ساخت پلاسمید نو­ترکیب pBRtnf

 

 

64

5-3- ساخت پلاسمید بیان کننده نو­ترکیب pET21tnf

67

6-3- بررسی بیان پروتئین نو­ترکیب در E. coli

71

7-3- مقایسه اثر غلظت­های مختلف IPTG در میزان بیان پروتئین

72

8-3- بررسی میزان بیان پروتئین در زمان­های مختلف بعد از القاء

73

9-3- وسترن بلاتینگ

74

فصل چهارم : بحث

 

4-1- بحث

75

فصل پنجم : نتیجه­گیری و پیشنهادات

 

نتیجه­گیری و پیشنهادات

80

منابع مورد استفاده

81

   

 

فهرست جداول

عنوان

جدول 1-1 : برخی از پروتئین­های نو­ترکیب موجود در بازار دارویی.............................3

جدول 2-1 : معایب و مزایای سیستم­های بیان کننده مختلف جهت تولید پروتئین­های نوترکیب.......12

جدول 3-1 : تعدادي از پروموترهاي مورد استفاده براي بيان ژن در E. coli..............17

جدول 1-2 :ترکیبات مورد نیاز در سنتز cDNA.........................................................40

جدول 2-2 : ترکیب واکنش PCR(مقادير بر حسب ميكروليتر)...................................42

جدول 3-2 : واکنش برش آنزيمي.................................................................................46

جدول 4-2 : ترکیبات واکنش اتصال TNF-αو pBR322......................................47

جدول 5-2 : فهرست سويه‌هاي E. coli استفاده شده در اين تحقيق..........................47

جدول 6-2 : ترکیبات محیط کشت LB.......................................................................48

جدول 7-2 : مخلوط واكنش براي برش آنزيمي............................................................54

جدول 8-2 : اجزاي واكنش اتصال................................................................................54

جدول 9-2 : تهیه12میلی­لیتر محلول ژل پایین با غلظت 10 در صد...........................57

جدول 10-2 : تهیه5میلی لیتر محلول ژل بالا با غلظت 4 در صد...............................57

جدول 11-2 : ترکیبات بافر نمونه (5x).......................................................................57

جدول 12-2 : ترکیبات بافرالکترود (بافر مخازن).........................................................57

 

فهرست اشكال

شکل 1-1 : اجزاء اوليه و اصلي وكتور بيان­كننده ژن درE. coli......................................16

شکل 2-1: نقشه كروموزوم MHC انسان و ژن hTNFα................................................27

شکل 3-1 : ساختار كريستالي TNFα بر گرفته از Protein Data Bank....................29

شکل 4-1 : شکل 4-1 مسیر سیگنالی TNFR1...............................................................33

شکل 1-2 : نقشه فیزیکی پلاسمید pBR322 (اقتباس از فرمنتاس)................................46

شکل2-2 : نقشه فیزیکی پلاسمید pET21a (+) (اقتباس از فرمنتاس)...........................53

شكل 1-3 : چهار نمونه خون انسان سالم..........................................................................62

شکل 2-3 : الکتروفورز RNA کل استخراج شده از 4 نمونه خونبا استفاده از کیت......63

شکل 3-3 : الکتروفورز محصول تکثیر شده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای نو­ترکیب با روش PCR و با پرایمرهای R و F بر روی ژل آگارز......................................64

شکل 4-3 : نقشه پلاسمید نوترکیبpBR322tnf ..........................................................65

شکل 5-3 : الگوی برش نخورده پلاسمیدهای نو­ترکیب pBRtnf در مقایسه با pBR322 فاقد cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفا.....................................................................66

شکل 6-3 : الکتروفورز محصول واکنش PCR بر روی پلاسمیدهای نو­ترکیب بر روی ژل آگارز.........67

شكل 7-3 : نقشه پلاسمید نوترکیب pET21tnf.............................................................68

شکل8-3 : نتایج الکتروفورز محصول PCRپلاسمید نو­ترکیب pETtnf با پرایمرهای R و F بر روی ژل آگارز...................................................................................................................................................69

شکل 9-3 : الکتروفورز محصول پلاسمید نوترکیب pET21tnf برش يافته با آنزیم های NdeI، HindIII و بریده شده با دو آنزیم NdeI- HindIIIبر روی ژل آگارز..............70

شکل10-3 : توالی نوکلئوتیدی ژن TNF و اسیدآمینه­ای ترجمه شده آن از یکی از کلون های نو­ترکیب به دست آمده، pET21tnf...............................................................71

شکل 11-3 : بیان ژن TNF-α انسانی در BL21E. coli.............................................72

شکل 12-3 : مقایسه غلظت­های مختلف IPTG بر روی بیان..........................................73

شکل 13-3 : مقایسه بیان پروتئین در زمان­های مختلف بعد از القاء..................................73

شکل 14-3 : نتایج وسترن بلاتینگ بیان پروتئین نوترکیب در غلظت­های 0625/0، 125/0، 5/0و 1 میلی­مولار..74

 

علايم اختصاري:

LB: Luria Bertani

NK cell: Natural killer cell

OD: Optical Density

TNF: Tumor Necrosis Factors

TAE: Tris-acetate EDTA

SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophoresis

RT-PCR: Reverse transcription polymerase chain reaction

rhTNF-α: Recombinant human Tumor Necrosis Factor alpha

MCS: Multiple cloning site

LPS: Lipopolysaccharide

IPTG: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

IL: Interleukin

INF: Interferon

EDTA: Ethylene diamine tetra acetic acid

DW: Distilled water

APS: Ammonium persulfate

MS: Multiple Sclerosis

TEMED: N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine or N,N,N,N-Tetramethyl-1,2-diaminoethan

TE: Tris EDTA

TM: Melting temperature

RCLB: Red Cell Lysis Buffer

CTL : Cytotoxic T cell

X-gal: bromo-chloro-indolyl-galactopyranoside

MHC: Major Histocompatibility Complex

AD: Alzheimers disease

PD: Parkinsons disease

LT: Lymphotoxin

TLR: Toll-like receptor

FADD: Fas-Associated protein with Death Domain

RIP: Receptor Interacting Protein

 

 

چکیده

سایتوکاین ها خانواده اي از فاكتورهاي رشد هستند که توسط سلول های سيستم ایمنی ترشح می شوند. این خانواده شامل اینترلوکین ها (IL)، اینترفرون ها (IFN)، فاکتور نکروز کننده تومور (TNF)، کموکاین ها و سایر فاکتورهای رشد میباشند. فاکتور نکروز کنندۀ تومور، بعنوان يك مولکولی با خصوصیات آنتی توموری است که عمدتاً توسط ماکروفاژهاي تحريك شده با باکتری ترشح میشود. عليرغم ابنكه مقادير محدودي TNF-α از منابع طبیعی آن بدست مي آيد اما مقادیر زیادی از فرم محلول آن (مورد نیاز برای مطالعات ساختاری و عملکردی) را میتوان به آسانی توسط تکنولوژی DNA نوترکیب به دست آورد. بنابراين ترجیح داده میشود براي توليد اين پروتئین نوترکیب از سیستم های ساده ميكروبي و نيز گیاهان استفاده گردد.

در اينجا به منظور مطالعه بیان TNFα انسانی، cDNA کد کنندۀ hTNFα حاصل از RT-PCR ي mRNA سلول های ماکروفاژ انسان، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی از قبل طراحی شده تکثیر گردید. محصول PCR خالص سازی شده، در سايت برشي EcoRV که در داخل ناحیه کد کننده مقاومت به تتراسایکلین در pBR322 بود، الحاق شد. سرانجام به منظور بيان، ژن هدف در پلاسمیدتحت کنترل سیگنال های رونویسی و ترجمه قوی پروموتور باکتریوفاژT7كلون گرديد به اين ترتيب كه وكتور نوتركيب و نيز هر دو با آنزيم هاي NdeI-HindIII بريده شده و قطعهDNA bp 478 حاصل از برش pBRtnf در pET21a(+) خطي شده، اتصال و سپس در E. coli DH5α ترانسفورم شد. پس از بررسي صحت کلونینگ (توسط تکنیک PCR و آنزیم های برشی) و توالی یابی قطعه کلون شده، بیان سیتوپلاسمی hTNFα نوترکیب در سویه BL21(DE3) E.coliاز طریق تکنیک های SDS-PAGEو نيز وسترن بلاتینگ مورد تاييد قرار گرفت.

 


مقدمه

فاکتور نکروز کننده تومور آلفا (TNF-α) سایتوکایني پیش التهابی است كه در راه اندازی و تنظیم سيستم ايمني ذاتی و پاسخ های التهابی حاد در برابر باکتری های گرم منفی و سایر میکروب هاي بیماری زا از طريق فراخواني نوتروفیلها و منوسیت ها به محل عفونت دخالت دارد. TNF-α براي اولين بار از سرم موش ها و خرگوشهایی که با سویه BCG مایکوباکتریوم بوویس يا آندوتوكسين باكتري ها تيمار شده بودند جداسازي شد كه در مرگ سلول هاي توموري نقش ايفاء مي كرد. اگر چه وجه تسمیه این فاکتور به علت ویژگی های ضد توموری آن است اما اين پلی پپتید 17 کیلودالتونی داراي عملكردهاي متعددي نظير دخالت در آپوپتوزیس، زنده ماندن سلول، التهاب، تنظيم خواب و رشد رويان مي باشد.اين فاكتور غالباً توسط ماکروفاژهای فعال، لنفوسیت هایT ي CD4+، لنفوسیت هایT ي CD8+، سلول های NK و ماست سل ها بيان مي شوند. بیان آن در سلول های دیگر مانند فیبروبلاست ها، سلول های عضلات صاف و سلول های توموری پایین است.

TNF-α نوترکیب امروزه به طور گسترده در تحقیقات علوم پایه و بالینی و نيز به منظور درمان تومور مورد استفاده قرار می گیرد. لذا با توجه به اهمیت آن تولید و تخلیص TNF-α به شکل نوترکیب در موجودات پروكاريوتي در كشور می تواند باعث فراهم شدن زمينه جهت انجام تحقیقات بعدی نظير تحقیقات ملکولی، پزشکی و بالینی بر روی این سایتوکاین مهم باشد. به علاوه امکان تولید آنتی بادی های منوکلونال و پلی کلونال برعلیه TNF-α که امروزه کاربردهای بسیار وسیعی در تشخیص و درمان بیماریهای مختلف دارند نيز فراهم می شود. از سوی دیگر با توجه به نقش ویژه TNF-α در مقابله با تومورهای سرطانی، تولید TNF نوترکیب می تواند دریچه ای نوین در برابر تحقیقات سرطان شناسی و نیز درمان تومورهای سرطانی فراروی محققین کشور بگشاید.

1-1- بیوتکنولوژی پروتئین­های دارویی

بیوتکنولوژی (زیستفناوری)، مجموعه فنونی است که از سیستم زنده برای تولید یا تغییر فرآورده­های زیستی در جهت بهداشت و اقتصاد عمومی استفاده می­کند(Wallman, 1997). گر­چه استفاده از میکروارگانیسم­ها برای تولید فرآورده­های زیستی دارای سابقه طولانی است ولی در زمینه بیوتکنولوژی مدرن امروزینظیر تکنیک­های مهندسی ژنتیک و تکنولوژی DNAنو­ترکیب، کاربرد فراوان دارند. اصطلاح بیوتکنولوژی نخستین بار در سال 1917توسط کارل ارکی[1] به کار برده شد. در سال 1973 هربرت بویر[2] و استنلی کوهن[3] تکنولوژی DNA نو­ترکیب را ارایه دادند و در سال 1976 اولين شركت مستقل بيوتكنولوژي،­Genentech، به منظور تجاري كردن اين تكنولوژي جديد تاسيس شد. در سال 1982 انسولین انسانی نو­ترکیب با استفاده از تكنولوژي DNA نوتركيب براي نخستين بار در E. coli به مرحله تولید رسید(Mckown and Coffman, 2002).پیش از بکار بردن روشهای بیوتکنولوژی، تنها منبع تولید پروتئین­های دارویی منابع طبیعی آنها نظیر خون و بافت­های انسانی و حیوانی بود که اغلب به میزان بسیار اندک و با صرف هزینه بسیار بالا تهیه می­شد. همچنین به دلیل مشکل بودن روشهای خالص سازی و از طرفی آلرژی­زا بودن پروتئین­های حیوانی برای انسان و امکان بروز اثرات جانبی، استفاده از این ترکیبات را محدود می­نمود(Brown, 2001). امروزه تکنولوژی DNA نو­ترکیب امکان آن را فراهم کرده است که بتوان cDNA کد کننده هر پروتئین را جدا کرده و به یک سیستم بیان کننده مناسب وارد کرد. در این حالت پروتئین مورد نظر در موجود بیگانه که اغلب یک میکروارگانیسم است،

 

 

بیان می­شود(Glick and Eds, 1998). به این ترتیب می­توان پروتئین­های دارویی را در مقیاس انبوه و بسیار ارزان­تر از روش­های قبلی تولید نمود(Walsh and Headon, 1994).

در حال حاضر بیش از 100 پروتئین دارویی نو­ترکیب برای درمان بیماری­های انسانی در بازار وجود دارد و در حدود 400 داروی جدید در درمان بیماری­های مختلف به ویژه سرطان، ایدز و ناراحتی­های دستگاه عصبی در مراحل کار آزمایی بالینی قرار دارند(Mckown and Coffman, 2002).

تکنولوژی دارویی مدرن از کلون کردن ژن و تکنولوژی DNA نوترکيب بهره می­گيرد. هدف نهايی بيوتکنولوژی دارويی ژن درمانی و ورود مواد ژنتيکی به سلول­ها برای جلوگيری يا کنترل و يا معالجه بيماری می­باشد(Ossege, Sindern et al., 1998). جدول 1-1 برخی از پروتئین­های دارویی تولید شده به صورت نو­ترکیب (T. A. Brown) را نشان می­دهد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 1-1: برخی از پروتئین­های نو­ترکیب موجود در بازار دارویی (T. A. Brown)

Used in the treatment of

Protein

Diabetes

Insulin

Growth disorders

Somatostatin

Growth disorders

Somatrotropin

Haemophilia

Factor VIII

Christmas disease

Factor IX

Leukamia and other cancers

Interferon-α

Cancers, AIDS

Interferon-β

Cancers, rheumatoid arthritis

Interferon-γ

Cancers, immune disorders

Interleukins

Cancers

Granulocyte colony stimulating factor

Cancers

Tumour necrosis factor

Ulcers

Epidermal growth factor

Ulcers

Fibroblast growth factor

Anaemia

Erythropoietin

Heart attack

Tissue plasminogen activator

Free radical damage in kidney transplants

Suproxide dismutase

Respiratory distress

Lung surfactant protein

Emphysema

1-antitrypsinα

Used as a plasma supplement

Serum albumin

Used to aid childbirth

Relaxin

 

1-2- کلون کردن ژن

كلون كردن عبارت است از به وجود آوردن نسخهکاملاً مشابه يك قسمتكوچكي از DNA، سلول و يا موجود كامل. كلون كردن ژن تحت عناوين كلون كردن مولكولي و تكنولوژيDNA نو­تركيب نيز شناخته مي­شود(Brown 1996). در این تکنیک يك توالي ژني را جدا كرده و با آنزیم اختصاصی برش می­دهند. سپس با استفاده از آنزیمDNA لیگاز[4]DNA مورد نظر در يك وكتور مناسب قرار داده می­شود. هیبرید حاصله را ConstructDNA گویند. که با انتقال به باکتری و یا سلول میزبان امکان تکثیر آن فراهم می­شود(Maeyer and De Maeyer-Guignard, 1998). در سال 1973، نخستین DNA نو­ترکیب با استفاده از آنزیم­های برشی و آنزیم لیگاز در دانشگاه Stanford آمریکا ساخته شد.

کشف تکنولوژی DNA نو­ترکیب سر­آغاز پیشرفت­های جدید در علوم و بیوتکنولوژی شد. یکی از خصوصیات مهم ژن کلون شده در تکنولوژی DNA نو­ترکیب، این است که اغلب می­تواند درون موجودی دیگر که کاملاً متفاوت با موجود اولیه است، فعالیت خود را انجام دهد(Michael and et., 1982). اهميت اصلي كلون كردن ژن به دست آوردن مقادير كافي از ژن­هاي مورد نظر براي تجزيه و تحليل بعدي است و امكان آزمايشات ژنتيكي براي فهم مكانيسم­هاي دخيل در بيماري­هاي ژنتيكي و در نتيجه پيدا كردن راهكارهاي مناسب براي تشخيص و درمان آنها را فراهم مي­آورد. كلون كردن ژن همچنين در داروسازي امروزه براي ساخت داروها با ساختار پروتئين نقش اساسي دارد. در حال حاضر یکی از مهمترین راهکارهای استفادة درمانی از این فناوری در توسعة روش­های درمانی نوین از جمله ژن درمانی است.

1-2-1- ابزار و عوامل کلون کردن ژن

همانطور که قبلاً ذکر شد اساس کلون کردن، برش دادن مولکول­های متفاوت DNA و اتصال دوبارة آنها است. برای این کار ابزارهای مولکولی لازم است که مهمترین آنها آنزیم­های محدود کننده[5] و آنزیم لیگاز هستند.

1-1-2-1- آنزیم­های برشی

در كلون كردن ژن، براي ايجاد يك مولكول DNAي نو­تركيب، ناقل بايستي به صورت کاملاً دقیق در يك نقطه مشخص(با امكان اتصال و برش دوباره) برش داده شود تا قطعه DNA كه قرار است، کلون

 

شود، در آن نقطه وارد گردد. اندونوكلئاز­هاي برشي، آنزيم­هايي هستند كه قطعه DNA را در مكان­هاي اختصاصي برش مي­دهند. اولين آنزيم برشي در سال 1970 از باكتري Haemophilus influenzaeجداسازي شد. انواع مختلف باکتری­ها انواع متفاوتی از این آنزیم­ها را تولید می­کنند. به همین دلیل اسامی آنها معمولاً از نام باکتری­های مولد آنها مشتق شده است(McDonald, 1996).

2-1-2-1- آنزيم DNA لیگاز

يكي از آنزيم­هاي مهم در سلول براي اتصال قطعات، DNA ليگاز ناميده مي­شود که موجب بازسازی پیوندهای فسفودی­استری از هم گسیخته می­گردد. هر گاه DNAي ناقل و DNAي خارجي هر دو با يك آنزيم برشي بريده شوند، نواحي انتهايي متناظر در ناقل و DNAي خارجي با يكديگر سازگار بوده و مكمل يكديگرند. و توالي­هاي تك رشته­اي انتهاهاي مكمل با هم جفت مي­شوند. ليگاز­ها روي قطعات برخوردار از گروه فسفات در انتهاي 5 عمل كرده و با ايجاد پيوند فسفودی­استری سبب بر­قراري اتصال بين دو توالي DNA مي­شوند، اين فرايند كه به اتصال[6] معروف است، آخرين مرحله ساخته شدن يك مولكول DNAي نو­تركيب است.

در کلون کردن ژن­ها نوع آنزيمي كه معمولاً مورد استفاده قرار مي­گيرد، DNA ليگاز T4 است كه از باكتري­هاي E. coliآلوده شده با باكتريوفاژ T4 به دست مي­آيد. زيرا اين آنزيم هم قادر به اتصال رشته هاي DNAي دو رشته­اي با انتهاي صاف و هم با انتهاي چسبان مي­باشد در حالي كه DNA ليگاز باكتري E. coli در اتصال قطعات با انتهاي صاف ناتوان است. دماي بهينه فعاليت هر دو آنزيم در سيستم بيولوژيكي 37 درجه است. ولي از آنجا كه براي اتصال قطعات جدا از هم و مكمل تشكيل اوليه

 

 

پيوندهاي هيدروژني بين نوكلئوتيدهاي مكمل ضروري است و در واكنش درون شيشه­اي[7] پيوندهاي هيدروژني، پايداري چنداني در مقابل دماي بالا ندارند به همين دليل اين نوع واكنش­ها در دماهاي پايين 16-4 درجه سانتيگراد و به مدت طولاني انجام شود(McDonald, 1996).

2-2-1- وکتورهای کلونینگ

براي اين كه بتوان قطعه­اي از DNAي دلخواه (موسوم به Insert DNA) را با استفاده از شرايط طبيعي (in vitro) تكثير كرده و براي مطالعات بيشتر استفاده نمود، لازم است DNA را توسط مولكول­هاي وکتور به سلول­هاي مورد نظر انتقال داد. در غير اين صورت، عمل انتقال، تكثير و يا استخراج DNAي مورد نظر امكان­پذير نمي­شود. نظر به اين كه قطعات تكثير شده همه با هم يكسان هستند، اين نوع متدولوژي به همسانه­سازي DNA موسوم است. مولكول­هاي وکتور DNA(DNAVector) كه خود DNA مي­باشند، بنا به داشتن توالي به خصوصي قادر هستند در سلول­هاي ميزبان خود به تعداد زيادي تكثير شوند. در اين صورت قطعه DNAي دلخواه نيز به همراه وکتور خود تكثير مي­شود.

وكتورهاي DNA تنوع بسيار زيادي دارند. مهمترين عامل طبقه­بندي آنها ميزان ظرفيت حمل DNA به سلول ميزبان است. قطعات DNA را مي­توان از چند نوكلئوتيد گرفته تا بيش از صد هزار نوكلئوتيد توسط وكتورهاي مناسب همسانه­سازي نمود. به همين دليل در طراحي اوليه بايد ابتدا اندازه DNAي مورد نظر را مشخص و وكتور مناسبي انتخاب نمود. پلاسمیدها، فاژλ، کاسمید و کروموزوم­های مصنوعی مخمر(Yeast artification chromosom) از وکتورهایی هستند که بیش از سایر وکتورها مورد استفاده قرار می­گیرد(Larry and Champness, 2007).

 

 

مشخصات كلي وكتورهاي كلونينگ

وكتورهاي مختلف DNA با تنوع بسيار زياد، شامل اندازه­ها و ظرفيت­هاي حمل مختلف موجود مي باشند، ولي داراي نقاط مشترك اساسي ذيل هستند:

· مبدا همانند­سازي[8]

همهوكتورها داراي توالي­هاي ويژه­اي هستند كه توسط آنزيم DNA پلي­مراز سلول ميزبان شناسايي شده و به تعداد بسيار زيادتر از ژنوم خود ميزبان تكثير مي­شوند اين توالي به مبدا همانند­سازي موسوم است وبا Ori نشان داده مي­شود. برخي وکتورها حاوي دو نوع Ori براي تكثير در دو نوع سلول ميزبان مي باشند. همانند­سازي وكتور توسط DNA پلي­مراز سلول ميزبان، در اين ناحيه شروع و در دو جهت (Bi-directional) مخالف هم ادامه مي­يابد.

  • نشانگرهای انتخابی[9]

همه وكتورها حامل ژن­هايي هستند كه به واسطه ايفايش آنها مي­توان وجود وكتور را به سهولت در داخل سلول ميزبان رديابي نمود. متداول­ترين نشانگرها، ژن­هايي هستند كه فرآورده آنها باعث بروز مقاومت در برابر آنتي­بيوتيك­هاي به خصوصي مي­شود. در صورتي كه وكتور به داخل سلول ميزبان حساس به يك آنتي­بيوتيك انتقال يابد، مي­تواند در حضور همان آنتي­بيوتيك زنده مانده و رشد كند. انواع نشانگرهاي رايجي كه مقاومت به آنتي­بيوتيك به خصوصي را در سلول ميزبان القاء مي­كنند، آمپي سيلين[10]، تتراسايكلين[11]، جنتامايسين[12]، كانامايسين[13] و استرپتومايسين[14] مي­باشند.

 

 

  • نشانگرهای ژنتیکی[15]

دسته ديگري از نشانگرها، ژن­هايي هستند كه عامل كنترل يك سري واكنش­هاي بيوشيميايي هستند. و در حضور مواد زمينه خاصي واكنش­هاي به خصوصي را بر­مي­انگيزند. مثلاً ژن LacZ كه استفاده از آن بسيار متداول مي­باشد در صورت انتقال به سويه­اي از باكتري E. coli كه اين ژن را ندارد باعث توليد آنزيم بتا-گالاكتوزيداز مي­شود كه مي­تواند روي ماده­اي بنام X-Gal اثر کرده و رنگ آبي در محيط اطراف سلول توليد کند. براي تشخيص اينكه سلول ميزبان حاوي وکتور DNA است، استفاده از يك نوع نشانگر كافي است ولي براي اينكه بتوان ماهيت وکتور را در رابطه با حامل بودن DNA وارد شده بررسي نمود، استفاده از نشانگرهاي ثانوي ضروري می­باشد.

  • جایگاه کلونینگ متعدد[16] (MCS)

براي اينكه بتوان DNA وارد شده را با استفاده از مكانيسم نوتركيبي[17] وارد قسمت خاصي از DNAي وکتور کرد، در ساده­ترين روش كار لازم است با استفاده از آنزيم­هاي برش دهنده هر دو DNA را برش داده و قطعات برشي و سپس دو نوع DNA را به هم اتصال داد در وکتورهاي جديد جايگاه کلونینگ يا MCS شامل توالي­هايي است كه حاوي توالي­هاي شناسايي و جايگاه برش براي آنزيم­هاي برش دهنده متعدد مي­باشد. در کلونینگ بايد از آنزيم­هايي استفاده كرد كه فقط مي­توانند يكبار DNA وکتور را مورد برش قرار دهند به همين دليل اين جايگاه­ها را جايگاه برشي منحصربه فرد مي­نامند. بنابر اين MCS هر وکتور جايگاه برشي آنزيم­هايي را ارائه مي­كند كه در تمامي طول وکتور منحصر به فرد[18]هستند. اگر­چه وجود MCS در يك وکتور الزامي است اما اين جايگاه بايد در مكان ويژه­اي در روي وکتور قرار گرفته باشد به طور رايج اين محل در ناحيه ´5 ژن LacZ قرار دارد كه وجود آن در اين محل در توليد فرآورده اين نشانگر اختلالي ايجاد نمي­كند در صورت وارد كردن DNA در جايگاه MCS توالي اين ژن مختل شده و عدم توليد كلوني­هاي آبي رنگ در حضور X-Gal وجود DNAي وارد شده را نشان مي­دهد.

  • جایگاه­های پروموتر[19]

بسته به هدف کلونینگ، وكتورهاي متفاوتي طراحي شده­اند و به منظور انجام عمليات مختلف، توالی­هاي ويژه­اي در يك يا دو رديف MCS قرار داده شده­اند. اين توالی­هاي اليگو­نوكلئوتيدي محل شناسايي و كنترل آنزيم­هاي مختلف از منابع متفاوت هستند كه در سويه­هاي مختلفE. coli موجود مي­باشند. به اين ترتيب بايستي براي اهداف و عمليات بخصوص، وكتور و سويه باكتري مناسب و سازگاري را انتخاب نمود. ممكن است هدف از کلونینگ توليد و تكثير DNA هدف، توليدmRNA از DNAي هدف يا اين كه توليد فرآورده پروتئيني کد شونده از DNAي هدف باشد. وجود پروموترهاي ويژه و آنزيم­هاي مربوطه انجام اين نوع عمليات را بر­عهده دارند.

Expression Vector

 



جهت کپی مطلب از ctrl+A استفاده نمایید نماید



p><!--EndFragment

  انتشار : ۱۱ مهر ۱۳۹۶               تعداد بازدید : 530

برچسب های مهم

دیدگاه های کاربران (0)

افزایش طول و قطر آلت تناسلی به روش ناچرال هیربال

افزایش طول و قطر آلت تناسلی به روش ناچرال هیربال

افزایش طول و قطر آلت تناسلی به روش ناچرال هیربال - فرصت ویژه : تخفیف 80 درصدی فقط برای این چند روز - افزایش طول و قطر آلت تناسلی به روش ناچرال هیربال در مدت کمتر از یک ماه و حل مشکلات جنسی مردان با روش های کاملا طبیعی و خانگی آیا می خواهید مشکلات جنسی شما برطرف شود و لذت بیشتری را ...

آموزش افزايش الت تناسلي به روش پيترتاك

افزایش طول و قطر آلت تناسلی به روش پيترتاك فرصت ویژه : تخفیف 51 درصدی به مدت محدود افزایش طول و قطر آلت تناسلی به روش پيترتاك در مدت کمتر از یک ماه و حل مشکلات جنسی مردان با روش های کاملا طبیعی و خانگی اگر واقعا می خواهید با ...

کسب درآمد اینترنتی 300000 تومان در خانه در کمتر از 30

کسب درآمد اینترنتی 300000 تومان در خانه در کمتر از 30

این محصول آپدیت شد تاریخ 1397/11/30 اضافه شدن ویدیوی جدید بسم الله الرحمن الرحیم کسب درآمد اینترنتی سلام در دنیای اینترنت خیلی از آدم ها هستند که دوست دارند کسب درآمد کنند و به خیلی چیزها و ایده ها فکر میکنند . همه ما دوست داریم در کمترین زمان بهترین درآمد را داشته باشیم ...

كسب درآمد اينترنتي روزانه حداقل ٧٠ هزار تومان

كسب درآمد اينترنتي روزانه حداقل ٧٠ هزار تومان

سلام دوست خوبم اگه از زندگي و كارت رضايت نداري.. اگه از وضعيت روحي و بي پولي خسته شدي.. اگه احساس ميكني هميشه تو تمامي كارها بازنده اي و اعتماد به نفس پاييني داري.. اگه ميخواي يك فعاليت جديد رو شروع كني .. و يا حتي ميخواي وضعيت زندگيتو بهتر و بهتر كني و جاذب ثروت و موفقيت ...

اد ممبر بینهایت ( افزایش ممبر(اعضای) کانال،ربات و

اد ممبر بینهایت ( افزایش ممبر(اعضای) کانال،ربات و

-اد ممبر بینهایت- {افزایش ممبر(اعضای) کانال،ربات و گروه تلگرام و...} Addmember نسخه ویژه(VIP) تمامی و کامل ترین نرم افزار های افزایش ممبر واقعی و فیک و آموزش های آن، که در اینترنت و بازار به قیمت های بالا به فروش می رسد را یک جا و مرتب و منظم به همراه راهنما در هر بخش، با ...

کسب درآمد 300هزار تومان در 60دقیقه

کسب درآمد 300هزار تومان در 60دقیقه

کسب درآمد 300/000تومان در 60 دقیقه توجه: دوستانی میان پیام میدن این سیستم شما چیه؟؟ شما اگه صفر تا صد توضیحات رو کامل بخونید ، اون موقع متوجه میشید ما گفتیم این روش چیه؟! پس حتما تا آخر توضیحات رو بخونید.( با این سیستم یاد میگیری چطوری از صفر با همین موبایلت روزی ۳۰ الی ۳۰۰ هزار تومن ...

کتاب پرفروش مغز گرسنه+کسب درآمد تضمینی

کتاب پرفروش مغز گرسنه+کسب درآمد تضمینی

شاید تعجب کنید از این حرف ولی بدون اقرار این یک کتاب مقدس است میپرسید چرا چرایش را در ادامه خواهید فهمید در این کتاب یاد خواهید گرفت که هدف های بزرگ و رویاهای بلند پروازانه داشته باشید. پایتان را از گلیم خود فراتر گذاشته و خود را از باب ارباب رعیتی نجات ...

افزایش قد با متد گرو تالر داینامیک

افزایش قد با متد گرو تالر داینامیک

بلند قامت بودن یک امتیاز بزرگ برای شماست! سلام بیتا بیات هستم کارشناس فیزیولوژی ورزشی،لازم دانستم قبل از این که شما با روش گرو تالر داینامیک آشنا شوید چند تا نکته رو صادقانه خدمتتان عرض کنم،خیلی اتفاقی با این متد آشنا شدم و قبل از آن همه روشها رو برای افزایش ...

آموزش رایگان کسب درآمد از سایت الیمپ

آموزش رایگان کسب درآمد از سایت الیمپ

خیلی از دوستان سوال پرسیدن در مورد نحوه ثبت نام که ما در ویدیو زیر تمام موارد را آموزش دادیم در ویدیو زیر در مورد نحوه ثبت نام در سایت الیمپ و آشنایی با تمام اجزای مهم سایت الیمپ توضیح دادیم . برای رفتن به سایت الیمپ اصلی کلیک کنید برای رفتن به سایت نمایندگی ...

دانلود رایگان کتاب سقوط یک بهشت pdf ترجمه

دانلود رایگان کتاب سقوط یک بهشت pdf ترجمه

معرفی کتاب:(سقوط یک بهشت)(واپسین روزهای سلطنت پهلوی)The Fall of Heavenنسخه فارسی کتاب The Fall of Heaven -سقوط یک بهشت-، کتابی است که نوشته یک تاریخ شناس برجسته آمریکایی Andrew Scott Cooper می باشد و مدتی قبل در ایالات متحده آمریکا منتشر شد.(سقوط یک بهشت)در این کتاب خواندنی، مؤلف برای نخستین بار در ...

آموزش افزایش آلت تناسلی به روش پیترتاک

آموزش افزایش آلت تناسلی به روش پیترتاک

افزایش طول و قطر آلت تناسلی به روش پيترتاك فرصت ویژه : تخفیف 50 درصدی به مدت محدود افزایش طول و قطر آلت تناسلی به روش پيترتاك در مدت کمتر از یک ماه و حل مشکلات جنسی مردان با روش های کاملا طبیعی و خانگی اگر واقعا می خواهید با مشکلات جنسیتان به کلی خدا ...

جزوه حقوق هوایی توپچی

جزوه حقوق هوایی توپچی

// جزوه حقوق هوایی برگرفته شده از کتاب مقدمه ای بر حقوق بین الملل هوایی حسین نواده توپچی مناسب برای دانشجویان دانشگاه پیام نور و سایر دانشگاه ها. پس از پرداخت لینک دانلود برای شما قابل نمایش میشود و تا یک روز لینک برای شما معتبر خواهد بود. جهت پشتیبانی میتوانید در زیر همین ...

افزایش سایز آلت تناسلی به روش Big Size

افزایش سایز آلت تناسلی به روش Big Size

اگر واقعا می خواهید با مشکلات جنسیتان به کلی خدا حافظی کنید لطفا مطالب زیر را با دقت بخوانید...! آیا از کوچکی آلت خود رنج میبرید؟ آیا زودانزالی دارید؟ آیا میخواهید یک بار برای همیشه مشکلات جنسی خود را رفع کنید؟ آیا میخواهید قدرت جنسی خود را افزایش دهید؟ در اين ...

دانلود رایگان کتاب روان درمانی اگزیستانسیال

دانلود رایگان کتاب روان درمانی اگزیستانسیال

معرفی کتاب:(روان درمانی اگزیستانسیال فارسی) روان درمانی اگزیستانسیال گونه ای روان درمانی پرکار یا پویه نگر است. پویا اصطلاحی ست که در حیطه ی بهداشت روان به چهره روان پویه شناسی بسیار بهره گیری می شود؛ و اگر کسی بخواهد یگانه از اساسی ترین ویژگی های رویکرد اگزیستانسیال را ...

نمونه سوالات فنی حرفه ای شیرینی پزی درجه 2

نمونه سوالات فنی حرفه ای شیرینی پزی درجه 2

این بسته پیشنهادی که توسط سایت حسام جمع آوری شده شامل: 400نمونه سوال تستی باجواب نام محصول:نمونه سوالات فنی حرفه ای شیرینی پزی درجه 2 تعداد مجموع سوالات: 400نمونه سوال با جواب آزمون ادواری نمونه سؤالات فنی حرفه ای شیرینی پزی درجه 2 می باشد که در ادامه می ...

پاورپوینت فصل پانزدهم تئوری حسابداری (جلد 2)

پاورپوینت فصل پانزدهم تئوری حسابداری (جلد 2)

Welcome to VirgooL.net مقاله ، پاورپوینت ، پایان نامه ---- ویرگــ ، ــول ViRGooL.net ---- پاورپوینت و مقاله موضوع : پاورپوینت فصل پانزدهم تئوری حسابداری (جلد 2) تألیف دکتر ساسان مهرانی، دکتر غلامرضا کرمی، مهتاب جهرومی و سیدمصطفی سیدحسینی مباحث پاورپوینت : - مقدمه - تعریف ...

کسب درآمد 650میلیون تومانی در یک روز کاملا تست

کسب درآمد 650میلیون تومانی در یک روز کاملا تست

اگه واقعا خواهان تغییر، موفقیت و درآمدزایی هستید، این صفحه رو کامل مطالعه کنید، در غیر این صورت میتونید با خیال راحت این صفحه رو ترک کنید :) سلام دوست عزیزم، ما در بین افراد موفق آمریکا، فیلسوف تجاری آمریکایی یعنی آقای جیم ران که خودش استاد چهار استاد ...

رسید جعلی آپ

رسید جعلی آپ

برنامه ساخت و ویرایش رسید جعلی برنامه آپ بسیار شبیه به رسید اصلی امکان ادیت تمام موارد به دلخواه کاملا راحت و تنها با یک کلیک با استفاده از این برنامه می توانید به راحتی رسید های برنامه ی پرداخت آپ را جعل نموده و با آن با دوستان خود شوخی نمایید.کار با برنامه بسیار راحت بوده و ...

پکیج افزایش قد -گروتالر داینامیک- نسخه جدید

پکیج افزایش قد -گروتالر داینامیک- نسخه جدید

آموزش جدیدترین و بهترین راه افزایش قد کودکان و بزرگسالان با -متد گروتالر داینامیک دکتر فیلیپ میلر- پکیج منحصر به فرد افزایش قد -گروتالر داینامیک- نسخه جدید 2019 (Grow Taller Dynamic) آموزش های ویدیویی جهت راحتی شما عزیزان اختصاصی از سایت Mss8.ir اگر تصور می‌ کنید که به ...

کسب درآمد در هر 3 دقیقه 5000 تومان

کسب درآمد در هر 3 دقیقه 5000 تومان

برای اینکه از همین امروز صاحب کسب و کار میلیونی شوید کافی است فقط چند دقیقه وقت بگذارید و توضیحات زیر را بخوانید. کسب درآمد میلیونی بدون نیاز به اینترنت شما توسط این پکیج می توانید در هر سه دقیقه ۵ هزار تومان درآمد کسب کنید. اگر شما فرد بیکاری هستید ؟ اگر ...

دانلودپکیج ربات فالوور و لایک نامحدود و رایگان

دانلودپکیج ربات فالوور و لایک نامحدود و رایگان

ربات فالوور و لایک نامحدود و رایگان اینستاگرام وضعیت پکیج : فعال روشی برای فالوور و لایک اینستاگرام براتون گذاشتیم، که با قیمت ناچیزی میتونید جلوی دوستاتون کلاس بزارین :) توجه : این برنامه مصارف دیگری هم دارد که خودتان با آن آشنا خواهید شد. اگر ...

كسب درآمد اينترنتي روزانه حداقل ٧٠ هزار تومان

كسب درآمد اينترنتي روزانه حداقل ٧٠ هزار تومان

سلام دوست خوبم اگه از زندگي و كارت رضايت نداري.. اگه از وضعيت روحي و بي پولي خسته شدي.. اگه احساس ميكني هميشه تو تمامي كارها بازنده اي و اعتماد به نفس پاييني داري.. اگه ميخواي يك فعاليت جديد رو شروع كني .. و يا حتي ميخواي وضعيت زندگيتو بهتر و بهتر كني و جاذب ثروت ...

دانلود رایگان کتاب شازده حمام صوتی تمام جلدها

دانلود رایگان کتاب شازده حمام صوتی تمام جلدها

معرفی کتاب:(شازده حمام)3جلد شازده حمام ، داستان خاطرات شیرین و خواندنی دوران کودکی حسین پاپلی یزدی در محله ای فقیرنشین در شهر یزد است .(شازده حمام) ااو درر ااین کتااب گوشه اای ااز ااوضاع ااجتماعی شهرر یزد راا درر دهه هاای 1330 توصیف می کند. پاپلی دانش آموخته ی جغرافیا در ایران و ...

قرارداد اجاره نامه سایز A3

قرارداد اجاره نامه سایز A3

قرارداد اجاره نامه سایز A3 شبیه ترین قرارداد اجاره نامه به قرارداد اتحادیه املاک ایران اگر میخواهید یک قرارداد با رعایت تمامی مقررات اتحادیه و قانون اساسی داشته باشید این فایل را دانلود کنید. تمامی بند ها مشابه با مفاد قرارداد اتحادیه میباشد. این اجاره نامه برای ...

کلید نمره گذاری فرم بلند نئو neo ( کلید نمره گذاری +

کلید نمره گذاری فرم بلند نئو neo ( کلید نمره گذاری +

پرسشنامه شخصیتی نئو- فرم 240 سوالی – NEOPI-R تعداد سوالات: 240 تعداد صفحات: 7 (پرسشنامه) + 4 (پاسخنامه-کلید نمره گذاری-تفسیر) شامل: پرسشنامه + پاسخنامه + کلید نمره گذاری + تفسیر نوع فایل: (پاسخنامه-کلید نمره گذاری-تفسیر) WORD + (پرسشنامه) PDF ...

دانلود کتاب مستند داستانی حیفا

دانلود کتاب مستند داستانی حیفا

عنوان کتاب: حیفا نویسنده: محمدرضا حدادپور جهرمی فرمت فایل: PDF تعداد صفحات: 204 ناشر: انتشارات معارف زبان: فارسی توضیحات: این مجموعه دربردارنده داستان زندگی و ماموریت دختری جاسوس از اداره ی متساوای سازمان موساد در منطقه غرب آسیاست. آن دختر، همانند دیگر خواهرانش به ...

حل المسائل فصل نهم ( تقطیر) کتاب عملیات واحد

حل المسائل فصل نهم ( تقطیر) کتاب عملیات واحد

حل المسائل فصل نهم ( تقطیر) کتاب عملیات واحد رابرت تریبال( جلد دوم) با توجه به موجود نبودن حل المسائل جلد دوم کتاب عملیات واحد رابرت تریبال، عده ای از دانشجویان کارشناسی ارشد مهندسی شیمی دانشگاههای معتبر تصمیم گرفتیم شروع به حل مسائل پایانی فصل های 9الی 14 این کتاب ...

اندیکاتور R & S جهت کسب درآمد از سایت الیمپ

اندیکاتور R & S جهت کسب درآمد از سایت الیمپ

خیلی از دوستان سوال پرسیدن در مورد نحوه ثبت نام که ما در ویدیو زیر تمام موارد را آموزش دادیم در ویدیو زیر در مورد نحوه ثبت نام در سایت الیمپ و آشنایی با تمام اجزای مهم سایت الیمپ توضیح دادیم . برای رفتن به سایت الیمپ اصلی کلیک کنید برای رفتن به ...

آموزش تله کینزی در دو روز

آموزش تله کینزی در دو روز

فقط در 2 روز...! توضیحات کم و مختصر نشانه نا کار آمد بودن مجموعه آموزشی نیست! با سلام. در این کتاب آموزش کامل تله کینزی را بصورت خیلی ساده و روان در اختیار شما قرار دادیم که هرکسی حتی در مبتدی ترین سطح میتواند تله کینزی را در کمترین زمان ممکن یاد بگیرد. آموزش هایی که داده شده ...

آموزش افزایش رایگان طلا در بازی آنلاین زولا

آموزش افزایش رایگان طلا در بازی آنلاین زولا

آموزش افزایش طلا در بازی آنلاین زولا بهترین پکیج آموزشی از نظر کاربران برای اطمینان بیشتر نظرات را بخوانید زولا یک بازی ایرانی می باشد که توسط ایرانیان زحمتکش ساخته شده است و سبک این بازی تفنگی ، اکشن ، آنلاین میباشد که در این بازی مراحل مختلفی وجود دارد که میتوانید ...

اعتبار ما اعتماد شما

فید خبر خوان    نقشه سایت    تماس با ما