شوری یکی از مهمترین تنش های غیر زیستی در گیاهان زراعی است. سطوح بالای سدیم سمی و مخالف تأثیر روند متابولیسم سلولی و تعادل یونی است. البته وجود مقادیر کم سدیم در سلول برای رشد گیاه حیاتی است. ژن مقاومت به شوری SOS1، آنتی پورتر Na⁺/H⁺غشای پلاسمایی را در گندم Triticum aestivumرمز می نماید. cDNA آن 3429 نوکلئوتید طول دارد که یک پلی پپتید با 1142 اسید آمینه و وزن 126 کیلو دالتون را رمز می نماید. یکی دیگر از ژن های موثر در مقاومت به شوری ژن LTP است. به نظر می رسد که ژن LTP هنگام تنش شوری در انتقال برون سلولی لیپیدها برای تولید واکس کوتیکولی برگ نقش آفرینی می کند. انواع پروتئین های LTP گیاهی دارای تعداد اسیدهای آمینه های مختلف از 91 تا 95 هستند. فاقد تریپتوفان بوده و دارای هشت باقیمانده سیستئین در موقعیت حفاظت شده هستند.LTP ها در انجام بسیاری از فرآیندهای فیزیولوژیکی شامل تنظیم فعالیت ساختن پکتین، رسوب مواد در دیواره دانه گرده در حال توسعه، تشکیل موانع ساختاری و تحریک مسیر پیام رسانی سیستمیک و رویان زایی از سلول های رویشی نقش دارند. LTPها پروتئین های حدود 9 کیلو دالتونی هستند که به مقادیر زیاد (حدود 4% از کل پروتئین های محلول) در گیاهان عالی یافت می شوند. در این پژوهش به منظور بررسی سطح بیان ژن های LTPو SOS1 آغازگرهای forward وreverse درNCBI طراحی شدند. بذرهای گندم الموت (ژنوتیپ حساس)، ارگ (ژنوتیپ متحمل) و آجیلوپس (ژنوتیپ وحشی) کشت شده در محیط کشت هیدروپونیک، تحت تنش NaClبا غلظت 150 میلی مولار قرار گرفتند و سپس در زمان های صفر، 3، 6 و 24 ساعت پس از تنش نمونه گیری انجام شد. به منظور دقت در کار دو ظرف به عنوان شاهد در نظر گرفته شد که در هر بار نمونه برداری در ساعت های مشخص از ظرف های شاهد هم نمونه برداری انجام شد. سپس بررسی بیان با استفاده از Real Time PCRانجام شد. بررسی بیان ژن SOS1درتنش شوری ثابت کرد که با افزایش زمان در غلظت 150 میلی مولار افزایش بیان وجود دارد که دلیل بر نقش این ژن القاء شونده به عنوان یک ژن موثر در تحمل تنش شوری در گیاه و امکان استفاده کاربری از آن در انتقال به گیاهان دیگر با هدف افزایش تحمل شوری می باشد. با مقایسه میزان بیان ژن LTP بین بافت های برگ و ریشه ارقام الموت ، ارگ و ژنوتیپ آجیلوپس می توان گفت که بیشترین میزان بیان در برگ آجیلوپس در 6 ساعت و در ریشه آجیلوپس در 3 ساعت بعد از تنش وجود داشته است و در تمام موارد تفاوت معنی داری بین برگ و ریشه آنها وجود دارد. همچنین، با مقایسه بین ارقام حساس( الموت ) و مقاوم( ارگ ) و ژنوتیپ وحشی( آجیلوپس ) می توان گفت که رقم مقاوم ارگ در بیان ژن LTPعکس العمل بهتری نسبت به رقم حساس الموت نشان داده است در نتیجه این مکانیسم در ایجاد مقاومت دررقم مقاوم مفیدتر است. همچنین مشخص شد که ژن LTPدر ایجاد مقاومت به شوری در گیاهان نقش دارد. بعلاوه مقایسه میزان بیان ژن SOS1بین برگ و ریشه در ارقام الموت و ارگ و آجیلوپس نشان داد که در اینجا نیز تفاوت معنی داری بین برگ و ریشه در هر ساعت بعد از تنش وجود دارد که این تفاوت تنها در 24 ساعت بعد از تنش در برگ و ریشه ارگ معنی دار نبود.

کلمات کلیدی: تنش شوری، پمپ غشایی Na⁺ / H⁺، ژنLTP، ژن SOS1 ، بیان ژن.

فهرست مطالب

عنوان صفحه

فصل اول: مقدمه و اهداف................................ 1

1-1-مقدمه............................................. 2

1-1-1 – تنش شوری................................... 2

1-1-2- اهمیت غلات................................... 3

1-1-3- گیاه شناسی گندم............................. 4

1-1-4-گندم امر..................................... 5

1-1-5- معرفی ژن SOS1............................... 5

1-1-6- معرفی ژنLTP................................. 6

1-2- راهکارهای مقابله با شوری در عصر حاضر............. 7

1-3- اهداف پژوهش...................................... 7

فصل دوم: مروری بر پژوهش های پیشین .................... 8

2-1- خاک های شور...................................... 9

2-2- چگونه شوری برای گیاه مشکل ایجاد می کند........... 10

2-3- مکانیسم های مقابله با تنش شوری در گیاهان......... 10

2-4- مکانیسم های مولکولی تحمل به تنش شوری............. 11

2-5- انواع گیاهان بر اساس واکنش رشد به شوری........... 11

2-6- ژنهای درگیر در تحمل به تنش شوری.................. 13

2-7- مسیر ژنهای SOSدر تحمل به تنش شوری............... 14

2-8- شناسایی و نامگذاری ژن LTP........................ 14

2-9- گروه بندی LTP ها................................. 16

2-10- معرفي واکنش Real-time PCR........................... 17

2-11- معرفي روش کمي سنجي مطلق (Absolute Quantification) براي کمي کردن بيان ژن درReal-time PCR ...................................................... 19

2-12-معرفي روش کمي سنجي نسبي Relative Quantification)) براي کمي کردن بيان ژن در Real-time PCR................................................... 20

2-13- تعيين راندمان Real-time PCR......................... 20

2-14- کمي کردن نسبي بيان ژن در Real-time PCRبا فرض راندمان100 درصد...................................................... 23

2-15- کمي کردن نسبي بيان ژن با Real-time PCRدر صورت متغير بودن راندمان يا کمتر از 100 درصد.................................... 24

2-16- تاثیر تنش­شوری بر ویژگی­های بیوشیمیایی............ 24

فصل سوم: مواد و روش تحقیق ............................ 27

3-1- انتخاب ژنوتيپ گندم ............................. 28

3-2-تأیید مقاومت رقم ارگ و حساسیت رقم الموت به تنش شوری 28

3-3-کاشت بذر ها................................ 28

3-4- انتخاب نوع محيط کشت مايع ........................ 30

3-5- شرايط کنترل شده محيط گلخانه ..................... 32

3-6- اعمال تنش شوری با نمک (150 میلی مولار) ........... 32

3-7- نمونه‌گيري از بافت برگي و ریشه ................... 33

3-8- استخراجRNA از بافت برگ و ریشه .................. 33

3-9- تيمار DNAse براي حذف آلودگي ژنومي در RNA استخراج شده 35

3-10- سنتز رشته اول cDNA از RNA ..................... 36

3-11- طراحي آغازگرهاي اختصاصي به منظور بررسي بيان ژنهای LTP و SOS1 ...................................................... 38

3-12-تکثير ‌‌cDNAهای سنتز شده با استفاده از آغازگرهای LTP، 18S rRNA وSOS1بوسیله واکنش زنجيره‌اي پليمراز (PCR) .............. 40

3-13- واكنش Real time RT-PCR (Relative)براي cDNA هاي تهيه شده . 42

3-14- واكنش Real time RT-PCR ژن LTP وSOS1 و ژن‌های كنترل داخلي 18S rRNA 42

3-15- روش نرمال‌سازي بيان ژنهای LTPوSOS1 پس از واكنش Real-time PCR 44

3-16- اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم پر اکسیداز (POD) 44

3-17- اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم کاتالاز(CAT) ..... 45

3-18-آنالیز پروموتر ژن های LTP وSOS1.................. 45

فصل چهارم: نتایج و بحث................................ 46

4-1- نتایج ........................................... 47

4-1-1- استخراج RNA ................................... 47

4-1-2- تعیین کمیت و کیفیت RNA استخراج شده ......... 47

4-1-3-كمي كردن ميزان بيان ژن LTP در شرايط تنش شوری با استفاده از RT-PCRReal time .................................... 48

4-1-4-كمي كردن ميزان بيان ژنSOS1در شرايط تنش شوری با استفاده ازRT-PCR Real time.................................... 53

4-1-5- اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم پر اکسیداز (POD) 58

4-1-6- اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم کاتالاز(CAT) . 62

4-1-7- نتایج آناليز پروموتر ژن‌ SOS1و LTPدر گیاه برنج 65

4-2- بحث ............................................. 68

4-2-1- بررسی سطح بیان ژن SOS1و نقش آن در سلول ..... 70

4-2-2- بررسی سطح بیان ژن LTPو نقش آن در سلول ..... 71

4-2-3-تاثیر تنش­شوری بر ویژگی­های بیوشیمیایی ...... 73

4-2-4- نتیجه گیری کلی ............................. 74

4-3- پیشنهاد ها ..................................... 75

فصل پنجم: منابع....................................... 77