عنوان

صفحه

فصل اول: مقدمه

1

فصل دوم: مروري بر پژوهش هاي پيشين

5

2- 1

گندم

6

2- 2

به نژادي گندم

7

2-2-1

زيست فناوري و گندم

8

2-2-2

کشت بافت گندم

9

2-2-2-1

انتخاب ريز نمونه

10

2-3

انتقال ژن به گندم

13

2-3-1

روش هاي مستقيم

14

2-3-1-1

بمباران ذره اي

14

2-3-1-2

الکتروپوريشن

16

2-3-1-3

روش هاي جايگزين

17

2-3-2

آگروباکتريوم

17

2-4

مشکلات انتقال ژن به گياهان تک لپه

23

2-5

پروموترها

25

2-5-1

انواع پروموتر

25

2-5-1-1

پروموترهاي بيان دايم

25

2-5-1-1-1

پروموترهاي پاتوژن هاي گياهي

26

2-5-1-1-1-1

پروموتر CaMV 35S

26

2-5-1-1-1-2

پروموترهاي اوپين

27

2-5-1-1-2

پروموترهاي تک لپه اي

27

2-5-1-1-2-1

پروموتر يوبي کوييتين گياهي (Ubi)

27

2-5-1-1-2-2

پروموتر اکتين1 برنج (Act-1)

29

2-5-1-1-2-3

پروموتر الکل دهيدروژناز ذرت (Adh-1)

30

2-5-1-2

پروموترهاي مختص بافت يا مراحل تکاملي

31

2-5-1-3

پروموترهاي القايي

32

2- 5-1-3-1

پروموترهاي تنظيمي با الکل

33

2- 5-1-3-2

پروموترهاي تنظيمي با تتراسايکلين

34

2- 5-1-3-3

پروموترهاي تنظيمي با استروييد

35

2- 5-1-3-4

پروموترهاي تنظيمي با فلزات

35

2- 5-1-3-5

پروموترهاي تنظيمي با پاتوژن ها

36

2- 5-1-3-6

پروموترهاي القاي فيزيکي

36

2-5-1-4

پروموترهاي سنتزي

37

2-6

نشانگر هاي ژنتيکي

37

2-6-1

نشانگرهاي گزارشگر

38

2-6-2

نشانگر­هاي گزينشگر

40

2-6-2-1

ژن هاي مقاومت به آنتي بيوتيک

40

2-6-2-2

ژن هاي مقاومت به علف کش

41

2-6-2-3

ژن هاي نشانگر متابوليکي

42

2-7

خاموشي تراژن در گندم

43

2-8

انتقال صفات با ارزش به گندم

44

2-8-1

بهبود ارزش غذايي

44

2-8-2

ايجاد نر غقيمي

45

2-8-3

مقاومت به تنش هاي زيستي

46

2-8-4

مقاومت به تنش هاي غيره زيستي

47

2-9

تنش

47

2-9-1

مسيرهاي ژن هاي القا شونده توسط تنش هاي غير زيستي

49

2-9-1-1

مسيرهاي وابسته به اسيد آبسيزيک

51

2-9-1-1-1

ژن هاي AREB / ABF

51

2-9-1-1-2

ژنMYB2 وMYC2

51

2-9-1-1-3

ژن­هاي NAC

52

2-9-1-2

مسيرهاي مستقل از اسيد آبسيزيک

52

2-9-1-2-1

خانواده عوامل رونويسي AP2/ERF

52

2-9-1-2-1-1

زير خانواده (AP2) APETALA2

53

2-9-1-2-1-2

زير خانوادهERF

53

2-9-1-2-1-3

زير خانواده RAV

54

2-9-1-2-1-4

زير خانواده DREB

54

2-10

WDREB2 (TaDREB2

57

فصل سوم: مواد و روش ها

59

3- 1

آماده کردن ژن WDREB2

60

3- 2

انتقال پلاسميد به باکتري آگروباکتريوم

60

3-2-1

استخراج پلاسميد هاي PBI121 داراي ژن WDREB2

60

3-2-2

تراريزش پلاسميدهاي pBI121 نوتركيب به درون سلولهاي مستعد آگروباکتريوم

62

3-2-3

انتخاب کلوني هاي نوترکيب

63

3-2-4

واکنش زنجيره اي پليمراز با پرايمرهاي اختصاصي براي تاييد تک کلون ها

63

3-2-5

نگهداري باکتري ها در گليسرول و تهيه استوک باکتري

65

3-3

تراريختي گياهان گندم با واسطه اگروباکتريوم

65

3-3-1

محيط كشت بافت گياهي

65

3-3-2

آماده سازي و کشت باکتري اگرو با باکتريوم جهت تلقيح

67

3-3-3

تلقيح، انتخاب و باززايي گياهان تراريخت

67

3-3-3-1

انتخاب و ضدعفوني بذر گندم

67

3-3-3-2

جداسازي جنين ها

68

3-3-3-3

تلقيح جنين­ها با باکتري آگروباکتريوم حاوي سازه

68

3-3-3-4

شستشوي جنين ها با آنتي­بيوتيک سفوتاکسيم

69

3-3-3-5

انتقال به محيط انتخابي، باززايي، ريشه­زايي

69

3-4

تاييد تراريختي

70

3-4-1

استخراج DNA گياهان تراريخت

70

3-4-2

واکنش زنجيره­اي پليمراز براي تاييد وجود ژن WDREB2 در گياهانتراريخت

72

3-4-3

استخراج RNA

72

3-4-5

سنتز رشته اول cDNA

74

3-4-6

انجام Real-Time PCR جهت مقايسه ميزان بيان ژن WDREB2 در گياهان تراريخت نسبت گياه شاهد غير تراريخت

76

فصل سوم: نتايج و بحث

78

4- 1

آماده کردن سازه ژن WDREB2

79

4- 2

تراريختي اگروباکتريوم

80

4- 3

تراريختي گياهان گندم با واسطه اگروباکتريوم

81

4- 4

استخراج DNA گياهان تراريخت

84

4- 5

واکنش زنجيره اي پليمراز براي تاييد وجود ژن WDREB2 در گياهان تراريخت

85

4- 6

استخراج RNA و ساخت cDNA

86

4- 7

انتقال به گلدان

87

4- 8

بحث

89

4-8-1

انتقال ژن به گياهان گندم

89

4-8-2

نتيجه گيري کلي

91

4-8-3

پيشنهادات

93

فهرست منابع

94

منابع فارسي

94

منابع انگليسي

94

فهرست جداول

عنوان

صفحه

جدول3-1 مواد استفاده شده در هر واکنش PCR و چرخه حرارتي واکنش زنجيره اي پليمراز TaDREB

64

جدول 3-2 ترکيبات محيط کشت هاي مختلف مورد استفاده در تراريختي گياهان گندم

66

جدول 3-3 بافر CTAB استفاده شده براي استخراج DNA

70

جدول 3-4 نوع و ميزان مواد بکار رفته براي تيمار DNase

74

جدول 3-5 مواد مورد استفاده در مرحله اول سنتز cDNA

74

جدول 3-6 مواد مورد استفاده در مرحله دوم سنتزcDNA

75

جدول 3-7 مواد به کار رفته در Real-Time PCR ژن WDREB2 و کنترل داخلي

76

جدول 3-8- سيكل گرمايي استفاده شده در Real-Time PCR ژن WDREB2......

77

جدول 3-9- سيكل گرمايي استفاده شده در Real-Time PCR ژن کنترل داخلي......

77

فهرست شکل ها

عنوان و شماره

صفحه

شکل2-1 عناصر سيستم تنظيمي يوبي کوييتين در گياهان

28

شکل 2-2 ژن اکتين برنج و عناصر پروموتري آن

29

شکل2-3- شبکه هاي تنظيمي بيان ژن هاي القا پذير به وسيله تنش هاي محيطي

50

شکل4-1 نقشه ناقل سازه WDREB pBI121

79

شکل 4-2 نقوش الکتروفورزي محصول PCR کلوني هاي نوترکيب اگروباکتريوم داراي سازه pBI+WDREB2

80

شکل 4-3 جنين هاي جداشده گندم روي محيط MS بدون هورمون

81

شکل 4-4 نگهداري گياهچه ها در محيط استراحت، قبل از بردن به محيط انتخابي

82

شکل 4-5 سفيد شدن گياهچه در محيط انتخابي بر اثر عامل گزنشگر جنتيسين

83

شکل 4-6 گياهچه ها در مرحله باززايي

84

شکل 4-7 نقوش الکتروفورزي DNA استخراج شده برخي از گياهان تراريخت

84

شکل 4-8 نقوش الکتروفورزي محصول PCR با پرايمر تخصصي ژن WDREB2

85

شکل4-9 نقوش الکتروفورزي PCR با پرايمرهاي تخصصي ژن WDREB جهت اطمينان از صحت cDNA

86

شکل4-10 نمودار نشان دهنده تک باند بودن و تخصصي بودن پرايمر

87

شکل4-11 آزمون Real Tim PCR ژنWDREB

87

شکل4-12 الگوي بيان ژن در گياهان ترايخت نسبت به گياه غيرتراريخت

88